Sistema de alfavirus Transducción: Herramientas para la Visualización de la infección en los mosquitos vectores

Los virus alfa son virus de ARN transmitidos por mosquitos que infectan de forma persistente células de mosquitos susceptibles con una citopatología mínima. Este protocolo muestra la utilidad de los sistemas de transducción de virus alfa infecciosos que expresan reporteros fluorescentes para la detección de infecciones vectoriales y transmisión de virus. En primer lugar, alimente a los mosquitos hembra con una comida de sangre que contenga el virus alfa de interés, luego determine la eficiencia de la infección por mosquitos y seleccione solo los mosquitos que expresan el gen marcador.

A continuación, recoja saliva de los mosquitos infectados y demuestre la transmisibilidad infectando las células de mosquito cultivadas con la saliva recolectada. Resultados obtenidos por microscopía epifluorescente. Visualice un informe de proteínas como GFP y así rastree la infección del vector y la transmisión del virus por especies de mosquitos ochenta o QE.

Los sistemas de expresión del virus alfa o ATS se pueden utilizar para evaluar rápidamente la expresión génica y los mosquitos vectores tanto para estudios de arbovirus como antes de realizar manipulaciones de mosquitos más difíciles, como la transgénesis de mosquitos. Irma Sánchez Vargas, el Dr. Eric Mossel y Aaron Phillips del laboratorio del Dr. Ken Olson demostrarán estos procedimientos. Para producir un virus TS en células Bhk 21, utilice un virus recombinante symbis que exprese el reportero GFP después de la transcripción in vitro, electrorratee el ARN del sistema de transducción del virus alfa genómico en células bhk 21.

Luego, rescata y amplifica el virus antes de la infección. Prepara a los mosquitos para una alimentación eficiente de sangre de un alimentador artificial por privación de alimentos. Retire el azúcar 24 horas y el agua 12 horas antes de la alimentación.

La mezcla de sangre animal desfibrilada o citrada obtenida comercialmente con el cultivo celular preparado derivó de una suspensión del virus TS para la infección eficiente del intestino medio de los mosquitos. Formule de 10 a siete unidades formadoras de placa por mililitro de título de virus para la harina de sangre para estimular a los mosquitos a hincharse. Añadir un TP hasta una concentración final de 0,02 molar.

Coloque una membrana intestinal de signo de poro sobre la boca del comedero de vidrio encamisado con agua. A continuación, configure los comederos con agua circulante a 37 grados centígrados. A continuación, pipetee la harina en la cámara y coloque los comederos de forma segura en la caja.

Después de alimentar a los mosquitos durante 10 a 30 minutos, clasifique los mosquitos con anestesia fría para los especímenes hinchados de sangre para permitir la replicación y diseminación de un virus TS en los mosquitos seleccionados. Incubarlos a 28 grados centígrados y 75% de humedad relativa durante ocho a 10 días. Con el fin de inmovilizar a los mosquitos.

Coloque la caja de papel a cuatro grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos. Ahora, transfiera de cinco a 10 mosquitos a una mesa de enfriamiento que esté adaptada para su uso en un microscopio fluorescente. Examine y clasifique los mosquitos según la presencia o ausencia de fluorescencia.

Devuelva los mosquitos seleccionados a la caja de papel para usarlos como desee. En este punto, determine la eficiencia de la infección utilizando la intensidad fluorescente como proxy. Por último, diseccione tejidos como el intestino medio, las glándulas SIV y los cuerpos grasos, y controle la fluorescencia.

Estos órganos y tejidos se pueden diseccionar en momentos más tempranos si se desea. Prive a los mosquitos de la fuente de azúcar durante las 24 horas previas a la alimentación. Prepare un tubo capilar de 50 microlitros que haya sido calentado, tirado y cortado con tres a cinco microlitros de Cargill.

Aceite de inmersión tipo B para garantizar que los mosquitos no se escapen. Quítale las patas y las alas. Ahora inserte el probos en el tubo.

Controle cuidadosamente las gotas de saliva que exudan desde el probos en el aceite de inmersión. Si es necesario, coloque una gota de pilocarpina al 1% en el tórax del mosquito para aumentar la salivación después de 60 a 90 minutos, retire los mosquitos y guárdelos para el aislamiento futuro del virus. Ahora, para recolectar la solución del tubo capilar, expulse la mezcla de aceite de saliva en un tubo que contenga 500 microlitros de 20% F-B-S-P-B-S estéril.

Filtre el inóculo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y luego use este inóculo para infectar células cultivadas en células de mosquitos. La eficacia de la infección con el virus DS MRE 16 GFP de cinco primos se evalúa mediante la expresión de GFP. Con el tiempo, estas células se infectaron con el virus a 0,01 de multiplicidad de infección.

Un microscopio de epifluorescencia permite ver todo el cuerpo de GFP en el mosquito infectado, así como en las diferentes partes del cuerpo aquí, a los 10 días después de la infección. La expresión selectiva de GFP en los órganos es indicativa de una infección diseminada. El intestino medio suele tener focos de infección distintos poco después de ingerir un virus que contiene sangre y que se propaga por todo el intestino medio posterior en momentos posteriores a la infección.

Estos eventos son señalados por los reporteros de GFP y DS RED. El ensayo de transmisión indica que cinco virus DS MRE 16 GFP principales expresan GFP de manera estable durante todo el período de incubación extrínseco. En este caso, la GFP y la saliva del mosquito se detectan tan pronto como ocho días después de la infección.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo infectar oralmente un virus A TS a un mosquito, cómo evaluar visualmente la infección viral en un mosquito y cómo evaluar la transmisión del virus desde el mosquito.