Sistema de alfavirus Transducción: Herramientas para la Visualización de la infección en los mosquitos vectores

Los alfavirus son virus de ARN transmitidos por mosquitos que infectan de forma persistente células de mosquitos susceptibles con mínima citopatología. Este protocolo muestra la utilidad de sistemas transductores de alfavirus infecciosos que expresan marcadores fluorescentes para la detección de la infección del vector y la transmisión del virus. Primero, administre a hembras de mosquitos una comida sanguínea que contenga el alfavirus de interés, luego determine la eficiencia de infección en los mosquitos y seleccione únicamente aquellos mosquitos que expresen el gen marcador.

A continuación, recolecte la saliva de los mosquitos infectados y demuestre la transmisibilidad infectando células de mosquitos cultivadas con la saliva recolectada. Resultados obtenidos mediante microscopía epi-fluorescente. Visualice un informe de una proteína como GFP y, de este modo, rastree la infección del vector y la transmisión del virus mediante especies de mosquitos del género Aedes o Culex.

Los sistemas de expresión de virus alfa o ATS pueden utilizarse para evaluar rápidamente la expresión génica y los mosquitos vectores, tanto en estudios de arbovirus como previamente a realizar manipulaciones más complejas de mosquitos, como la transgénesis de mosquitos. Estos procedimientos serán demostrados por la Dra. Irma Sanchez Vargas, el Dr. Eric Mossel y Aaron Phillips del laboratorio del Dr. Ken Olson. Con el fin de producir un virus TS en células BHK-21, utilice un virus recombinante symbis que exprese el reportero GFP tras la transcripción in vitro, y electrotransfiera el ARN del sistema transducente de virus alfa genómico en células BHK-21.

Luego rescate y amplifique el virus antes de la infección. Prepare los mosquitos para una alimentación eficiente con sangre a partir de un alimentador artificial mediante la privación de alimento. Retire el azúcar 24 horas y el agua 12 horas antes de la alimentación.

Mezcle sangre animal defibrilada o citrada obtenida comercialmente con la suspensión de virus TS derivada del cultivo celular preparada para lograr una infección eficiente del intestino medio de los mosquitos. Formule una titulación de virus de 10 a la siete unidades formadoras de placas por mililitro para la comida sanguínea, con el fin de estimular a los mosquitos a ingerir abundantemente. Añada TP hasta una concentración final de 0,02 molar.

Coloque una membrana intestinal de signo de poro sobre la boca del alimentador de vidrio con camisa de agua. A continuación, prepare los alimentadores con agua circulante a 37 grados Celsius. Luego, aspire la comida con una pipeta y colóquela en la cámara, y coloque los alimentadores firmemente sobre el cartón.

Después de alimentar a los mosquitos durante 10 a 30 minutos, separe los mosquitos anestesiados con frío para seleccionar los especímenes con sangre ingerida, lo que permitirá la replicación y diseminación de un virus TS en los mosquitos seleccionados. Incúbelos a 28 grados Celsius y 75 % de humedad relativa durante ocho a 10 días. Con el fin de inmovilizar a los mosquitos.

Coloque el cartón que sostiene el papel a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 15 minutos. A continuación, transfiera de cinco a diez mosquitos a una mesa de enfriamiento adaptada para su uso en un microscopio fluorescente. Examine y clasifique los mosquitos según la presencia o ausencia de fluorescencia.

Devuelva los mosquitos seleccionados al cartón de papel para su uso según sea necesario. En este momento, determine la eficiencia de infección utilizando la intensidad fluorescente como indicador. Finalmente, seccione tejidos como los intestinos medios, las glándulas salivales y los cuerpos grasos, y supervise la presencia de fluorescencia.

Estos órganos y tejidos pueden diseccionarse en momentos anteriores si se desea. Deprivar a los mosquitos de la fuente de azúcar durante 24 horas antes de la alimentación. Prepare un tubo capilar de 50 microlitros que haya sido calentado, estirado y cortado con tres a cinco microlitros de Cargill.

Añada aceite de inmersión tipo B para asegurarse de que los mosquitos no escapen. Retíreles las patas y las alas. Ahora inserte las probóscides en el tubo.

Monitoree cuidadosamente las gotas de saliva que exudan de la probóscide al aceite de inmersión. Si es necesario, coloque una gota de pilocarpina al 1% sobre el tórax del mosquito para aumentar la salivación después de 60 a 90 minutos, retire los mosquitos y guárdelos para un futuro aislamiento del virus. Ahora, para recolectar la solución del tubo capilar, expulse la mezcla de saliva y aceite en un tubo que contenga 500 microlitros de PBS estéril con 20% de FBS.

Filtre el inóculo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrones y luego utilice este inóculo para infectar células cultivadas en células de mosquito. La eficacia de la infección con el virus GFP DS MRE 16 cinco prime se evalúa mediante la expresión de GFP. Con el tiempo, estas células fueron infectadas con el virus a una multiplicidad de infección de 0,01.

Un microscopio de fluorescencia epi permite observar el cuerpo entero con GFP en el mosquito infectado, así como en las diferentes partes del cuerpo a los 10 días posteriores a la infección. La expresión selectiva de GFP en órganos indica una infección diseminada. Los intestinos medios suelen presentar focos de infección distintos poco después de ingerir una comida sanguínea que contiene el virus, los cuales se extienden por todo el intestino medio posterior en momentos posteriores a la infección.

Estos eventos son señalizados por los reporteros GFP y DS RED. El ensayo de transmisión indica que el virus GFP DS MRE 16 cinco prime expresa establemente GFP durante todo el período de incubación extrínseco. En el mosquito, se detecta GFP y saliva de mosquito tan pronto como ocho días posteriores a la infección.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar oralmente un virus ATS a un mosquito, cómo evaluar visualmente la infección viral en un mosquito y cómo evaluar la transmisión del virus por parte del mosquito.