Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores
30 de octubre de 2016
virus Vaccinia (VV) se ha utilizado ampliamente en la investigación biomédica y la mejora de la salud humana. Este artículo describe un método simple, altamente eficiente para editar el genoma VV usando un sistema de CRISPR-Cas9.
El objetivo general de este experimento es mejorar la eficiencia de la generación del virus vaccinia mutante mediante el uso de la tecnología CRISPR-Cas9. Este método puede ayudar a crear nuevos vectores del virus vaccinia para la investigación biológica y la investigación médica, en particular para la terapia génica y la vacunación. La demostración viral con este método es fundamental, ya que es difícil identificar y recoger las placas positivas.
La principal ventaja de esta técnica es que mejora drásticamente la eficiencia en la fabricación de nuestro mutante, el virus vaccinia. Comenzando con las células CV-1 recolectadas, ajuste su concentración a 100.000 células por mililitro. A continuación, siembre dos mililitros de la suspensión en cada pocillo de una placa de seis pocillos para la transfección.
Al día siguiente, transfecte las células con 0,5 nanogramos de plásmido gRNA-N2 y 0,5 nanogramos de plásmido pSTCas9. Luego incubarlos durante 24 horas. 24 horas después, reemplace el medio.
A continuación, prepare el virus VVL15. Diluir el virus VVL15 de la columna vertebral con DMEM a 200.000 PFU por mililitro. A continuación, añada 100 microlitros del virus diluido en cada pocillo de las células CV-1 transfectadas.
Dos horas más tarde, transfecte las células con un microgramo del vector donante lanzadera para la expresión de HR e incube las células durante 24 horas. Al día siguiente, separe las células CV-1 transfectadas con un raspador de células. A continuación, recoja la suspensión celular en un criovial y guárdela a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.
Para comenzar la primera ronda de purificación del VV modificado, siembre 15 placas de seis pocillos con 300.000 células CV-1 no modificadas por pocillo. Al día siguiente, descongele la suspensión congelada de células CV-1 transfectadas a 37 grados centígrados durante tres minutos y, a continuación, agite vigorosamente la suspensión durante 30 segundos para lisar las células. A continuación, diluir un microlitro del lisado con tres mililitros de DMEM.
Agregue medio mililitro de esta dilución a cada pocillo de placas de células CV-1 no modificadas. Luego regrese las placas a la incubadora durante dos días. Dos días después, identifique las placas positivas a RFP con un microscopio de fluorescencia.
Se pueden detectar con un objetivo 10X. A medida que se identifiquen, etiquete con precisión las placas debajo de la placa con un rotulador. Ahora prepare un criovial que contenga 200 microlitros de DMEM sin suero para cada placa positiva que se vaya a recolectar.
A continuación, es importante aspirar todo el medio de los pocillos con placas etiquetadas. A continuación, utilizando un juego de pipetas de 200 microlitros para aspirar 30 microlitros, cargue parcialmente la pipeta con 10 microlitros de medio de la criovial y, a continuación, raspe la placa y extraiga las células con la aspiración restante. Expulse esto en el criovial y repita este procedimiento dos veces más, apuntando a la misma placa RFP positiva para recolectar tantas células como sea posible.
Almacene las colecciones a menos 80 grados centígrados o, si la segunda ronda de purificación se va a realizar inmediatamente, congele los crioviales en hielo seco durante 10 minutos. La segunda ronda de purificación del VV modificado se realiza igual que la primera utilizando las células congeladas de la primera ronda. Sin embargo, se pueden seleccionar más de seis placas RFP positivas para cada línea RFP positiva.
Repita el proceso de selección hasta que todas las placas formadas a partir de una placa positiva sean RFP positivas, lo que indica que la placa es pura, lo que puede llevar de tres a cinco rondas adicionales. Con un día de anticipación, prepare una placa de seis paredes con medio millón de células CV-1 por pocillo. Al día siguiente, descongele la placa purificada congelada a 37 grados centígrados durante tres minutos.
A continuación, agite la placa vigorosamente durante 30 segundos para hacer un lisado. Agregue todo el lisado, incluidos los restos de células, en un pocillo de células CV-1 e incube la placa durante tres días. No use los otros cinco pozos.
Inspeccione las células diariamente bajo un microscopio. Cuando más de la mitad de las células parezcan citopáticas, recoja las células infectadas. Lo ideal es que todas las células sean citopáticas.
Use un raspador de células para recolectar las células en un tubo de 15 mililitros con medio de cultivo. A continuación, pegue las células a 300 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y proceda con el uso de PCR para verificar la modificación del VV mutante, o congele el pellet de la célula a menos 80 grados centígrados para hacerlo más tarde.
El método descrito mejora la eficiencia de recombinación en más de 100 veces en comparación con los protocolos convencionales. Por ejemplo, el VV N1LG estaba destinado a ser modificado. Como se describió, los plasmas que expresan Cas9 y un ARNg específico de N1L se transfectaron conjuntamente en las células CV-1 para mejorar su eficiencia para la recombinación homóloga.
Un día después de la transfección, la RFP se expresó en las células CV-1. A continuación, las células CV-1 se infectaron con el lisado completo de la recombinación homóloga. Se observaron placas RFP positivas y negativas en las células CV-1.
Siguiendo el protocolo de purificación, se obtuvo un recombinante puro. Todas las placas después de la infección con el lisado celular derivado de una placa pura con el virus vaccinia mutante presentaron una señal RFP. Se utilizó la PCR para verificar la deleción del gen diana.
El virus modificado mostró una señal positiva para RFP y ninguna señal para N1L, a diferencia del control N1L intacto. Todos fueron positivos para el gen no objetivo A52R. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear rápidamente un nuevo vector de virus vaccinia.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 días si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias biomédicas exploraran nuevos vectores virales en el desarrollo de agentes biológicos para el tratamiento y la prevención del cáncer y las enfermedades infecciosas.
Descripción general
Este artículo presenta un método altamente eficiente para editar el genoma del virus vaccinia (VV) utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. La técnica mejora significativamente la generación de VV mutantes, facilitando avances en la investigación biológica y médica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Ingeniería Genética
- Investigación Biomédica
Antecedentes
- El virus de la vaccinia es una herramienta valiosa en la investigación biomédica.
- La tecnología CRISPR-Cas9 permite la edición precisa del genoma.
- La generación eficiente de mutantes virales es crucial para aplicaciones de investigación.
- Los métodos tradicionales de generación de mutantes pueden ser ineficientes.
Objetivo del estudio
- Mejorar la eficiencia en la generación de virus vaccinia mutantes.
- Desarrollar nuevos vectores virales para terapia génica y vacunación.
- Agilizar la identificación de placas positivas en ensayos virales.
Métodos Utilizados
- Transfección de células CV-1 con plásmidos de ARN-g y Cas9.
- Infección de células transfectadas con el virus VVL15.
- Identificación de placas positivas para RFP mediante microscopía de fluorescencia.
- Purificación del VV modificado mediante múltiples rondas de selección.
Resultados principales
- El método mejora la eficiencia de recombinación en más de 100 veces.
- La generación exitosa de placas positivas para RFP indica una modificación efectiva.
- La PCR confirmó la eliminación de los genes diana en el virus modificado.
- La técnica puede completarse en aproximadamente 10 días.
Conclusiones
- Este método CRISPR-Cas9 representa un avance significativo para la investigación del VV.
- Permite el desarrollo rápido de nuevos vectores virales para aplicaciones terapéuticas.
- El enfoque puede facilitar estudios adicionales en el tratamiento del cáncer y de enfermedades infecciosas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este enfoque CRISPR-Cas9 aborda un cuello de botella clave en el desarrollo de vectores virales al mejorar significativamente la eficiencia de generación de cepas mutantes del virus de la vaccinia. La eficiencia mejorada de recombinación permite una iteración más rápida en la validación preclínica de dianas y en los flujos de trabajo de optimización de vectores. El método posibilita la generación rápida de virus recombinantes para la investigación de terapia génica y vacunas, reduciendo los plazos en las etapas iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación precisa de la función génica viral mediante la eliminación dirigida, como la supresión de N1L, para aclarar los mecanismos patógenos.
- Valor operativo: Mejora la eficiencia de generación de virus recombinantes en más de 100 veces en comparación con la recombinación homóloga tradicional, acelerando los plazos de ingeniería de cepas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al permitir modificaciones genéticas limpias que posibilitan la atribución inequívoca del fenotipo en ensayos posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera virus marcadores etiquetados con RFP que permiten ensayos de placas cuantitativos basados en fluorescencia para la selección de alto rendimiento de compuestos antivirales o respuestas inmunitarias.
- Valor operativo: Produce lotes virales estables y puros tras varias rondas de purificación, asegurando la reproducibilidad del ensayo y reduciendo la variabilidad en los resultados.
- Escalabilidad: El protocolo utiliza equipos estándar de cultivo celular y transfección, lo que permite su adaptación a diferentes escalas de laboratorio sin necesidad de instrumentación especializada.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona una plataforma para la construcción de vectores de virus vaccinia que expresan antígenos terapéuticos o inmunomoduladores, destinados a la evaluación preclínica en modelos de cáncer y enfermedades infecciosas.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Permite la generación rápida de cepas virales isogénicas (por ejemplo, tipo salvaje frente a cepas con deleción del gen N1L) para desentrañar los mecanismos de virulencia y apoyar el perfilado de seguridad.
- Avance Ajustado al Riesgo: Las deleciones génicas verificadas por PCR y la expresión de RFP permiten tomar decisiones confiables de avance o interrupción del estudio basadas en la fidelidad genética antes de realizar estudios in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento temprano hasta la identificación de compuestos líderes, donde la ingeniería rápida de vectores virales apoya la prueba de hipótesis sobre dianas y la validación mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la edición guiada por hipótesis de genomas virales para investigar la función génica en vías de evasión inmunitaria o replicación.
- Selección: Genera lotes virales estandarizados que expresan RFP, adecuados para ensayos de cribado basados en fluorescencia en estudios de eficacia de antivirales o vacunas.
- Análisis: Permite lecturas basadas en PCR y fluorescencia para evaluar cuantitativamente la eficiencia de modificación y la pureza clonal durante el desarrollo del vector.
- Investigación Traducional: Asegura continuidad desde la construcción del vector hasta las pruebas preclínicas, al proporcionar virus genéticamente definidos con integración confirmada del transgén y eliminación génica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la ingeniería del virus vaccinia que puede aplicarse a múltiples objetivos y cargas de transgenes en programas de vectores virales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Edición del genoma de alta fidelidad con una mejora medible en la eficiencia de recombinación, lo que reduce los falsos negativos en el cribado de mutantes.
- Valor operativo: Flujo de trabajo optimizado que utiliza reactivos accesibles (plásmidos, células CV-1, microscopía de fluorescencia), minimizando las barreras técnicas para su adopción.
- Valor estratégico: Acelera los ciclos de diseño-construcción-prueba de vectores virales, mejorando la eficiencia del capital en programas tempranos de biológicos.
- Impacto en la cartera: Permite la prototipificación rápida de vectores virales, apoyando la exploración paralela de múltiples candidatos y la priorización informada basada en la validación genética.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular en la transfección de plásmidos y manejo viral bajo condiciones de BSL-2.
- Depende de microscopía de fluorescencia para la selección de placas y equipo estándar de PCR para la verificación genotípica.
- Necesita optimización del diseño del ARN-g y del vector donador para cada locus diana para mantener la especificidad de edición.
- Aplicable a líneas celulares adherentes de mamífero como CV-1; la adaptación a otros sistemas puede requerir pruebas empíricas.
- Se necesitan varias rondas de purificación de placas para lograr pureza clonal, lo que afecta el tiempo de manipulación directa a pesar del plazo total de 10 días.
