Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores

virus Vaccinia (VV) se ha utilizado ampliamente en la investigación biomédica y la mejora de la salud humana. Este artículo describe un método simple, altamente eficiente para editar el genoma VV usando un sistema de CRISPR-Cas9.

El objetivo general de este experimento es mejorar la eficiencia de la generación del virus vaccinia mutante mediante el uso de la tecnología CRISPR-Cas9. Este método puede ayudar a crear nuevos vectores del virus vaccinia para la investigación biológica y la investigación médica, en particular para la terapia génica y la vacunación. La demostración viral con este método es fundamental, ya que es difícil identificar y recoger las placas positivas.

La principal ventaja de esta técnica es que mejora drásticamente la eficiencia en la fabricación de nuestro mutante, el virus vaccinia. Comenzando con las células CV-1 recolectadas, ajuste su concentración a 100.000 células por mililitro. A continuación, siembre dos mililitros de la suspensión en cada pocillo de una placa de seis pocillos para la transfección.

Al día siguiente, transfecte las células con 0,5 nanogramos de plásmido gRNA-N2 y 0,5 nanogramos de plásmido pSTCas9. Luego incubarlos durante 24 horas. 24 horas después, reemplace el medio.

A continuación, prepare el virus VVL15. Diluir el virus VVL15 de la columna vertebral con DMEM a 200.000 PFU por mililitro. A continuación, añada 100 microlitros del virus diluido en cada pocillo de las células CV-1 transfectadas.

Dos horas más tarde, transfecte las células con un microgramo del vector donante lanzadera para la expresión de HR e incube las células durante 24 horas. Al día siguiente, separe las células CV-1 transfectadas con un raspador de células. A continuación, recoja la suspensión celular en un criovial y guárdela a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.

Para comenzar la primera ronda de purificación del VV modificado, siembre 15 placas de seis pocillos con 300.000 células CV-1 no modificadas por pocillo. Al día siguiente, descongele la suspensión congelada de células CV-1 transfectadas a 37 grados centígrados durante tres minutos y, a continuación, agite vigorosamente la suspensión durante 30 segundos para lisar las células. A continuación, diluir un microlitro del lisado con tres mililitros de DMEM.

Agregue medio mililitro de esta dilución a cada pocillo de placas de células CV-1 no modificadas. Luego regrese las placas a la incubadora durante dos días. Dos días después, identifique las placas positivas a RFP con un microscopio de fluorescencia.

Se pueden detectar con un objetivo 10X. A medida que se identifiquen, etiquete con precisión las placas debajo de la placa con un rotulador. Ahora prepare un criovial que contenga 200 microlitros de DMEM sin suero para cada placa positiva que se vaya a recolectar.

A continuación, es importante aspirar todo el medio de los pocillos con placas etiquetadas. A continuación, utilizando un juego de pipetas de 200 microlitros para aspirar 30 microlitros, cargue parcialmente la pipeta con 10 microlitros de medio de la criovial y, a continuación, raspe la placa y extraiga las células con la aspiración restante. Expulse esto en el criovial y repita este procedimiento dos veces más, apuntando a la misma placa RFP positiva para recolectar tantas células como sea posible.

Almacene las colecciones a menos 80 grados centígrados o, si la segunda ronda de purificación se va a realizar inmediatamente, congele los crioviales en hielo seco durante 10 minutos. La segunda ronda de purificación del VV modificado se realiza igual que la primera utilizando las células congeladas de la primera ronda. Sin embargo, se pueden seleccionar más de seis placas RFP positivas para cada línea RFP positiva.

Repita el proceso de selección hasta que todas las placas formadas a partir de una placa positiva sean RFP positivas, lo que indica que la placa es pura, lo que puede llevar de tres a cinco rondas adicionales. Con un día de anticipación, prepare una placa de seis paredes con medio millón de células CV-1 por pocillo. Al día siguiente, descongele la placa purificada congelada a 37 grados centígrados durante tres minutos.

A continuación, agite la placa vigorosamente durante 30 segundos para hacer un lisado. Agregue todo el lisado, incluidos los restos de células, en un pocillo de células CV-1 e incube la placa durante tres días. No use los otros cinco pozos.

Inspeccione las células diariamente bajo un microscopio. Cuando más de la mitad de las células parezcan citopáticas, recoja las células infectadas. Lo ideal es que todas las células sean citopáticas.

Use un raspador de células para recolectar las células en un tubo de 15 mililitros con medio de cultivo. A continuación, pegue las células a 300 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y proceda con el uso de PCR para verificar la modificación del VV mutante, o congele el pellet de la célula a menos 80 grados centígrados para hacerlo más tarde.

El método descrito mejora la eficiencia de recombinación en más de 100 veces en comparación con los protocolos convencionales. Por ejemplo, el VV N1LG estaba destinado a ser modificado. Como se describió, los plasmas que expresan Cas9 y un ARNg específico de N1L se transfectaron conjuntamente en las células CV-1 para mejorar su eficiencia para la recombinación homóloga.

Un día después de la transfección, la RFP se expresó en las células CV-1. A continuación, las células CV-1 se infectaron con el lisado completo de la recombinación homóloga. Se observaron placas RFP positivas y negativas en las células CV-1.

Siguiendo el protocolo de purificación, se obtuvo un recombinante puro. Todas las placas después de la infección con el lisado celular derivado de una placa pura con el virus vaccinia mutante presentaron una señal RFP. Se utilizó la PCR para verificar la deleción del gen diana.

El virus modificado mostró una señal positiva para RFP y ninguna señal para N1L, a diferencia del control N1L intacto. Todos fueron positivos para el gen no objetivo A52R. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear rápidamente un nuevo vector de virus vaccinia.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 días si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias biomédicas exploraran nuevos vectores virales en el desarrollo de agentes biológicos para el tratamiento y la prevención del cáncer y las enfermedades infecciosas.