Name: Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a generar mutantes del virus vaccinia con CRISPR-Cas9 para investigación biomédica y terapia génica. Este método mejora la eficiencia de recombinación más de 100 veces respecto a protocolos convencionales.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención MRC DPFS (MR/M015696/1) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2013DFG32080).

1. Preparación de ARN diana y Cas9 Las construcciones y reparación de Donantes del vector <ol><li> Clonación de gRNAs <ol><li> Diseñar una secuencia diana de ARN-guía en el gen del virus vaccinia N1L siguiendo el principio establecido previamente 25. Alinear la secuencia diana guía-ARN contra el genoma del virus vaccinia (en este caso, Lister cepa de virus vaccinia) para descartar cualquier secuencias diana gRNA fuera de objetivo. </li><li> Sintetizar y clonar oligos gRNA en un vector de clonación gRNA como se describió anteriormente 25. Confirmar la secuencia de cada gRNA individual en el vector resultante por secuenciación de Sanger 33. Nombre del gRNA construcción resultante como gRNA N2 33. NOTA: El sitio diana gRNA está dentro del gen N1L, y está en la región entre el brazo izquierdo y el brazo derecho que las cubiertas vector reparación donantes (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Clonar el gen Cas9 que carece de la señal de localización nuclear (NLS) en lavector pST1374 y designar el constructo como pST-Cas9 33. NOTA: Cualquier expresión vector de clonación de mamíferos puede ser utilizado para la construcción del vector de expresión Cas9. </li><li> Construcción del vector de la reparación de los donantes para los recursos humanos <ol><li> Utilice el gen de VV N1L como la región diana para la modificación 33. Asegúrese de que las longitudes de los brazos izquierdo y derecho son de 500 a 600 pb cada uno, y que flanquean la región diana. NOTA: El brazo izquierdo / brazo derecho puede tener hasta 50 pb solapamiento con la región diana (Ver Figura 1). </li><li> Clonar la reparación región vector donante N1L como se describió anteriormente 33, 34 y designar el vector donante de reparación como pT-N1L. NOTA: Véase la Figura 1 para el vector de la reparación de los donantes y su región de destino. Otras regiones del VV se pueden apuntar usando región (gen) específicos de gRNA (s) y el vector de reparación de donantes específicos de la región. Cualquier vector de clonación puede ser utilizado para la construcción del vector de reparación donante. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> La expansión del plásmido <ol><li> Transformar el plásmido en E. químicamente competente coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó el plásmido usando un kit de extracción de plásmido en referencia con el protocolo suministrado por el fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Las células de la siembra (Día 1) <ol><li> Mantener células CV-1 (fibroblastos de riñón de mono) en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina, a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> trypsinize células CV-1 que son 80-90% de confluencia <ol><li> Retire el medio de cultivo celular de las T-175 matraz que contenía células CV-1. Enjuagar la monocapa con 5 ml de PBS estéril para eliminar el suero residual y aspirar el PBS. Añadir 2,5 ml de solución 1 × tripsina-EDTA para cubrir las células y se coloca el matraz en 37 ° C incubadora durante aproximadamente 5 min para ayudar a la separación de células. </li><li> Añadir10 ml de medio de cultivo celular (véase el paso 2.1) para suspender las células por acción de la pipeta suave. Contar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Siembra de las células en placas de 6 pocillos <ol><li> Seed 2 × 10 5 células CV-1 en 2 ml de medio de cultivo celular en cada pocillo de una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección. NOTA: una etapa de centrifugación adicional para eliminar la tripsina no es necesario. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. La transfección de plásmido y Cas9 gRNA plásmido (Día 2) <ol><li> transfectar células CV-1 (preparados en la etapa 2.2.3.1) con 0,5 mg de pST-Cas9 plásmido y 0,5 g de plásmido gRNA N2 usando un reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Se incuban las células durante 24 h en una incubadora (37 ° C con 5% de CO 2), y luego sustituir el medio con 2 ml de medio de cultivo celular fresco (descrito en el paso 2.1). </li></ol> 4. La infección de CV 1-Cells y traslado de los donantes VLa transfección ector para HR (día 3) <ol><li> Diluir la columna vertebral virus VVL15 con medio de cultivo celular DMEM a una concentración de 2 × 10 5 pfu / ml. 24 h después de la transfección de plásmidos Cas9 y gRNA, añadir 100 l de virus diluido en cada pocillo de las células CV-1 transfectadas. </li><li> 2 h después de la infección de virus, transfectar 1,0 g de traslado vector donante en las células infectadas por el VVL15 de HR usando un reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Colocar las células transfectadas en una incubadora a 37 ° con 5% de CO2 durante 24 h. </li></ol> 5. recoger el virus recombinante (día 4) <ol><li> Después de 24 h de transfección con el vector donante de enlace para los recursos humanos en el paso 4.2, separar las células CV-1 transfectadas utilizando un rascador de células. Recoger la suspensión de células en un criovial y almacenar a -80 ° C para uso futuro. NOTA: Limpie el derrame medio de cultivo celular con desinfectante inmediatamente y limpie de nuevo con 70% etanol. </li></ol> 6. La purificación del VV Modificado (Primera Ronda) <ol><li> El día 1, sembrar 15 placas de 6 pocillos con 3 × 10 5 células CV-1 en cada pocillo. <ol><li> En el día 2, descongelar la suspensión celular congelada de la etapa 5.1 en un baño de agua a 37 ° C durante 3 min y agitar los crioviales vigorosamente durante 30 s para obtener el lisado celular sin la eliminación de los desechos celulares. </li></ol></li><li> Para la infección de una placa de 6 pocillos de células CV-1, diluir 1 l de lisado celular con 3 ml de DMEM y añadir 0,5 ml del lisado celular diluido en cada pocillo de la placa de 6 pocillos, en la parte superior de los medios de comunicación ya presente. Infectar a todas las placas de 6 pocillos preparados en la etapa 6.1. NOTA: No es necesario retirar los restos celulares. </li><li> Después de dos días de la infección (es decir, el día 4), identificar las placas positivas RFP con un microscopio de fluorescencia utilizando 10X lente objetivo y la etiqueta de las placas debajo de la placa usando un rotulador con un círculo la ubicación de la placa. NOTA: Ver <strong&gt; Figura 3 para placa representativa RFP-positivo. <ol><li> Preparar seis crioviales marcado que contiene 200 l de medio de cultivo celular DMEM libre de suero para recoger seis placas positivas RFP diferentes. Aspirar el medio de cultivo celular del pozo con la placa marcada (s) (paso 6.3). Coloque una punta de 200 l con una pipeta P200, ajustar el volumen a 30 l y tomar ~ medio de cultivo celular 10 l de un criovial. </li><li> Mantenga pulsado el botón de empuje de la pipeta sin soltar el medio y el uso de la punta a arañar la superficie de una placa de marcado. Suelte el botón pipeta de empuje para levantar las células desprendidas y la transfiere en el criovial que contiene 190 l de DMEM libre de suero. </li><li> Tome otro soporte del vial con las células rayados (desde la ultima etapa) 10 l y repita el procedimiento de recoger la misma placa RFP-positivo tres veces para recoger la mayor cantidad de células rayados como sea posible. Transferencia de todas las células en el mismo vial y almacenar el vial a -80 ° C. </ol></li></ol> 7. La purificación del VV Modificado (Segunda Ronda) <ol><li> Semilla 3 × 10 5 células CV-1 en cada pocillo de seis placas de 6 pocillos y cultivar las células durante 24 h. </li><li> Descongelar los crioviales congelados (de la etapa 6.3.3) en 37 ° C baño de agua durante 3 minutos, a continuación, los crioviales vórtice vigorosamente durante 30 segundos para obtener lisado celular. <ol><li> Añadir 0,5 l de lisado de células mixtas a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Infectar una placa de 6 pocillos para cada placa. Se incuban las placas de 6 pocillos infectados con VV a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 días (segunda purificación en placa y vuelta). A continuación, repita la sección 6.3. NOTA: Más de seis placas de RFP-positivas pueden ser recogidos; dos o más placas de 6 pocillos se pueden utilizar para la purificación de cada placa. </li></ol></li></ol> 8. nuevas rondas de placa Purificación <ol><li> Llevar a cabo un período de tres a cinco rondas de purificación siguiendo el mismo protocolo descrito en la etapa 7 hasta que todas las placas formadas a partir de una placa positiva parecen ser RFP-positivas bajo un microscopio. NOTA: Esta placa entonces se considera puro. </li><li> Una vez que la placa es pura (Figura 4, todas las células infectadas que expresan RFP), la cosecha de una placa positiva en un criovial y se almacena a -80 ° C como se describe en la sección 6.3. Verificar la placa siguiendo el protocolo descrito en el paso 9 y 10. </li></ol> 9. Ampliar el purificada placa (s) <ol><li> Seed 3 × 10 5 células CV-1 en cada pocillo de algún día placa de 6 pocillos antes de la infección de virus. </li><li> Descongelar la criovial congelado desde el 8,2 en un baño de agua a 37 ° C durante 3 minutos para obtener el lisado celular. Añadir todo el lisado (sin la eliminación de restos de células) en un pocillo de una placa de 6 pocillos de células CV-1 (cabeza de serie en el paso 9.1). Se incuban las células CV-1 infectadas a 37 ° C con 5% De CO2 durante un máximo de 3 días. <ol><li> Expandir todas las placas purificadas (al menos tres placas). NOTA: El tiempo de la infección varía de 1-3 días, dependiendo de la cantidad de virus en el lisado. </li></ol></li><li> Recoger las células infectadas por VV utilizando un rascador de células cuando más de 50% de células muestran un efecto citopático observado con un microscopio (células se redondean, fácilmente separada y RFP positivo). Recoger las células separadas junto con medio de cultivo celular en un tubo de 15 ml. <ol><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 g durante 3 min. Eliminar el sobrenadante y mantener el sedimento celular a -80 ° C hasta su uso posterior o utilizar el sedimento celular inmediatamente para el paso 10. </li></ol></li></ol> 10. Verificación de la modificación del mutante VV Usando PCR <ol><li> Extracto de ADN VV del sedimento celular preparado en la etapa 9.3.1 usando un kit de extracción de DNA siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir el ADN con 200 l de agua bidestilada. Nota: El uso medio del volumen de la pastilla para extraer el ADN y mantener el resto para la producción viral si el clon se verifica como correcta que contiene la modificación / inserción. </li><li> Verificación de la deleción del gen N1L y la inserción de genes RFP en la región N1L. <ol><li> Amplificar un fragmento de ADN que abarca el gen N1L (L025) y la L026 de genes utilizando cebadores diseñados contra el gen N1L. Amplificar el gen RFP utilizando cebadores específicos de RFP. Amplificar un fragmento de ADN que abarca el control A52R por PCR utilizando cebadores específicos A52R. NOTA: Ver Lista de Materiales para la primers específicos. <ol><li> Realizar la PCR utilizando un kit de PCR master mix. Colocada a 25 l de reacción de PCR usando 2 l de ADN plantilla, desnaturalizar la reacción de PCR a 94 ° C durante 2 minutos, y luego correr 30 ciclos de PCR siguiendo estos pasos: desnaturalizar el ADN a 94 ° C durante 15 s, a continuación, recocido los cebadores a los moldes de ADN a 52 ° C durante 15 s amplían la reacción de PCR a 72 ° C durante 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Resolver los productos de la PCR usando un gel de agarosa al 1% 33. Para capturar la imagen en gel utilizando un documento de gel UV. Si el PCR es negativa y N1L A52R y RFP PCR son positivos, a continuación, la placa se modifica correctamente en la región N1L. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hay dos objetivos principales con respecto a la modificación de VV con fines terapéuticos. Una de ellas es para eliminar un gen particular, tal como el gen de la timidina quinasa (TK) para atenuar virus para uso terapéutico anti-tumor. El otro es para armar VV con un gen terapéutico deseado (por ejemplo, GM-CSF) o un gen marcador (por ejemplo, gen de la luciferasa). El logro de cualquiera de éstos consiste en la deleción de una región objetivo / gen. Un método de ligadura de ADN directa 35 y un método de empaquetamiento in vitro 36 se han utilizado previamente para generar virus vaccinia mutantes con modificaciones gen tk. Sin embargo, estos métodos han aplicación con respecto a la mutación de otras regiones en el genoma limitado debido a la falta de sitios de enzimas de restricción únicos en todo el genoma. El enfoque actual a la creación de VV mutante implica la transfección de un vector lanzadera (donante) con un marcador de selección (RFP o GFP) en células CV-1 dos horas después de la infección con VV de inducir una recombinación homóloga de plásticng el marcador de selección en la región diana. La selección de placas de marcador positivo es seguido por la purificación de 24 h después de la transfección. El proceso de purificación de la placa puede tardar hasta 10 rondas, las últimas 3-4 semanas y, a menudo conduce a los virus recombinantes no deseadas con marcadores de selección insertadas en las regiones fuera de objetivo. ADN de doble filamento se rompe pueden inducir eficazmente la recombinación homóloga en células de mamíferos 37, y el aprovechamiento de este mecanismo, la eficiencia de la generación de VV mutante puede ser mejorado enormemente. El sistema Cas9 gRNA guiada se ha empleado con éxito en la edición del genoma y la mejora de la eficiencia de la recombinación homóloga en organismos eucarióticos 22, 25. Recientemente, en células huésped de los genomas de adenovirus y de tipo I del virus del herpes simple fueron editadas por el Cas9 guiada por gRNA sistema 24. Se ha demostrado recientemente que el sistema de CRISPR Cas9 es una poderosa herramienta para la edición de manera eficiente el genoma VV y la construcción de un vector para expresar un VVen particular de genes. Tanto el método tradicional de recombinación homóloga (HR) Cas9 guiada por gRNA N1L y resultaron en eventos de recursos humanos con éxito en el mismo lugar de destino de N1L. Curiosamente, sin embargo gRNA guiada HR inducida Cas9 a niveles mucho más altos de eficiencia que el método de HR tradicional. Por lo tanto, el uso de Cas9 guiada por gRNA elimina la necesidad de purificar el mayor número de placas para obtener VV mutantes. En este trabajo, hemos mejorado significativamente la eficiencia y el calendario para la generación de VV mutante utilizando el sistema de guiado Cas9-gRNA 33. De nota, un paso crítico para la obtención de una alta eficiencia de la recombinación homóloga es para transfectar células CV-1 con los plásmidos que expresan Cas9 y la gRNA durante 24 h antes de realizar la recombinación homóloga convencional. El intervalo de 24 h permite Cas9 y gRNA a ser expresadas en un nivel razonable. Además, puede ser necesario optimizar la secuencia gRNA dirigidas a un gen particular en lo que se encontró que los diferentes gRNA secuencias de tgen argeting N1L variar en su eficacia 33, 34. La limitación de la CRISPR / Cas9 en VV edición es la baja tasa de placas RFP-positivas en la primera ronda de recombinación. Para obtener un número suficiente de placas de RFP-positivas que contienen virus recombinante, por lo general por lo menos diez se necesitan placas de 6 pocillos, lo que hace de primera ronda de cribado tedioso. Por lo tanto, todavía hay una necesidad de optimizar el protocolo para superar esta limitación. El pequeño tamaño de placas RFP-positivo es otro problema potencial, que es debido a un alto volumen de lisado se usó para infectar una placa de 6 pocillos. Para superar esto, un menor volumen de lisado se debe utilizar para infectar una placa de 6 pocillos para obtener placas RFP-positivo mayor tamaño. El uso de un menor volumen de lisado también permitirá una mejor separación de las placas de RFP-positivo de los RFP-negativo. En consecuencia se requieren menos rondas de purificación de placas para obtener placas puras RFP-positivo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; fuera de objetivo efectos son siempre un problema no deseado en la edición de genes. CRISPR-Cas9 ha mostrado efectos fuera de la meta. Sin embargo, con un diseño cuidadoso de gRNA, fuera de objetivo efectos pueden ser evitados cuando se edita el VV genomas 33, 34. Esta es la ventaja particular de usar el sistema Cas9 guiada por gRNA para editar el genoma de VV. Teniendo en cuenta las promesas de VV, usando el sistema de CRISPR / Cas9 acelerará el desarrollo de VV mutantes para la investigación biomédica y en la medicina traslacional. Además, tal sistema también acelerar descubrimientos en biología celular, tales como la disección de las vías de señalización utilizados por VV para su motilidad basado en actina.

El virus vaccinia (VV) es un virus de ADN con envoltura que pertenece a la familia de los poxvirus y ha desempeñado un papel crucial en uno de los mayores logros de la medicina de la erradicación de la viruela. En la era posterior a la erradicación de la viruela, VV se ha desarrollado como un vector para la entrega de genes para las vacunas contra el VIH y otras enfermedades infecciosas 1-7 mediante la inserción de genes de diversos patógenos en vectores de VV. VV también se ha utilizado ampliamente como un vector para la inmunoterapia del cáncer 8-14 especialmente para el desarrollo de virus vaccinia oncolítico de replicación específica de tumor. Con el fin de crear un vector de vacuna eficiente con una mejor selectividad para las células cancerosas, se requieren modificaciones en el genoma viral, incluyendo deleciones de genes o la introducción de genes terapéuticos. Con el desarrollo de la tecnología del ADN y una mejor comprensión de la biología molecular y la virología, la inserción de ADN extraño en VV fue lograr originalmented usando recombinación homóloga (HR) en 1980 15. Este método sigue siendo ampliamente utilizado para la construcción de vectores VV. La introducción de la modificación genética se logra mediante el uso de un vector lanzadera para HR, que se recombina con el genoma VV de células pre-infectados. Sin embargo, este método ha demostrado ser muy ineficiente (menos de 1% de eficiencia de la recombinación homóloga 16) y a menudo resulta en la inserción aleatoria del marcador de selección en las regiones no diana y / o la pérdida del marcador después de la expansión de virus. La eficiencia de la recombinación homóloga de ADN para la inserción de ADN exógeno en loci genómico se puede mejorar de manera espectacular en la presencia de roturas de la doble hebra (DSB) 17. Por lo tanto, la tecnología que puede inducir DSBs en loci diana tiene un gran potencial para la ingeniería del genoma de VV. El sistema CRISPR-Cas9 recientemente desarrollado se muestra prometedor para la activación de las DSB en cualquier región del gen de VV. CRISPR-Cas9 es un ARNnucleasa guiada implicados en la inmunidad adaptativa contra la invasión de los fagos y otros materiales genéticos foráneos 18-20. Hay tres sistemas de CRISPR-cas en una gama de 21 especies microbianas. El sistema de CRISPR-cas de tipo II es ampliamente utilizado para la edición del genoma de células eucariotas y virus grandes. Se compone de la endonucleasa de Cas9 RNA-guiado (de Streptococcus pyogenes), una sola guía de ARN (sgRNA) y la crRNA activadora trans (tracrRNA) 22-24. El complejo Cas9 / sgRNA reconoce la secuencia genómica de 20 nucleótidos complementaria que precede a una secuencia 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer motivo adyacente (PAM) en células de mamíferos 22, 23. Se ha utilizado con éxito para la generación eficaz de las células, los virus modificados genéticamente y modelos animales 22-32. El sistema CRISPR-Cas9 ha demostrado ser una herramienta eficaz para el genoma de orientación en combinación con la recombinación homóloga en el citoplasma de las células infectadas por VV CV-1s para generar virus vaccinia mutantes 33, 34. Con el fin de extender la aplicación potencial de este método, se presenta información detallada sobre la metodología de este sistema. El protocolo descrito se puede utilizar para crear un VV mutante con una deleción del gen particular y / o armar el virus mutante con un transgén terapéutico.

<table><tbody><tr><td>Plásmido #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>vector de clonación de ARNg</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 clonación</td></tr> vector <tr><td>pGEMT fácil</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>reparación clonación de vectores donantes</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Químicamente competente E. coli</td><td>C4040-10</td><td>Transformación</td>de <td>Invitrogen</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>27106</td><td>Extracción de plásmidos</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila' s Medio (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td> Cultivo <td>de células</td><td>hiclónicas</td></tr><tr><td>penicilina sérica, estreptomicina</td><td>15070-063</td><td>Antibióticos Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Transfección</td>de<td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Vial criogénico; 2.0&nbsp; mL</td><td>W-06754-96</td> Microscopio de fluorescencia <td>de virus Thermo</td><td>Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fluorescencia Olympus BX51&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>encuentra la plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tejidos</td><td>69506</td><td>Qiagen</td> Extensor de <td>extracción de ADN</td></tr><tr><td>PCR largo ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Reactivo Thermo Scientific</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 10 cm</td><td>Z688819-6EA</td><td>cultivo celular sigma</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Z707759</td><td></td><td>cultivo celular Sigma&nbsp;</td></tr><tr><td>rascador de células</td><td>C5981</td><td>Sigma</td> células <td>de chatarra</td></tr><tr><td>1x Solución de tripsina-EDTA</td><td>T4299</td><td>Sigma</td><td>células tripsinizadas</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectante</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>suspensión de celda de retención</td></tr><tr><td>N1L adelante 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'</td><td></td><td>Imprimación para</td><td>PCR</td>Sigma</tr><tr><td>N1L reversa&nbsp; 5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'Imprimación</td><td></td> <td>para PCR</td> <td>Sigma</td></tr><tr><td>A52R adelante 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>primer A52R reverso 5'-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3'</td><td></td><td>Imprimación Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>RFP forward 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3' &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>primer RFP reverso 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>primer Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR producto</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia vectores

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

La endonucleasa Cas9 asociada a CRISPR puede editar loci genómicos particulares dirigidos por un solo ARN guía (ARNg). El sistema CRISPR/Cas9 se ha empleado con éxito para editar genomas de varios organismos. En este trabajo describimos un protocolo para editar el genoma del virus vaccinia (VV) en el citoplasma de células CV-1 infectadas con VV utilizando el Cas9 guiado por ARN. Cas9 guiado por ARN induce roturas de ADN bicatenario, lo que facilita la recombinación homóloga de manera eficiente y específica en el sitio objetivo de VV, y se puede incorporar un transgén a estos sitios por recombinación homóloga. Mediante el uso de un vector homólogo de sitio específico con transgén(es), se generó un VV delecionado por el gen N1L con el gen de la proteína de fluorescencia roja (RFP) incorporado en esta región con una eficiencia de recombinación exitosa 10 veces mayor que la obtenida con el método convencional de recombinación homóloga. Este protocolo demuestra el uso exitoso del sistema Cas9 guiado por ARN para generar VV mutantes con mayor eficiencia.

Para la construcción de un nuevo vector VV, el punto de partida clave es diseñar y construir un vector lanzadera de donantes que pueden dirigirse a una región particular del genoma. En este estudio, el gen VV N1L se utilizó como un objetivo de ejemplo. El casete del vector lanzadera de donante para la recombinación y la región objetivo en el VV se muestra en la Figura 1. Con el fin de mejorar la eficiencia de la recombinación homóloga, los plásmidos que expresan Cas9 y un gRNA N1L-específica se co-transfectaron en el CV -1 células 48 h antes de realizar la recombinación homóloga 33. Un día (24 h) después de la transfección, RFP se expresó en las células CV-1 (Figura 2). Después de la infección de células CV-1 con todo el lisado a partir de la recombinación homóloga (paso 5), RFP-positivas y placas negativas se observan tanto en las células CV-1 (Figura 3). Siguiendo el protocolo de purificación descrito, una placa co pura<html> ULD ser obtenido después de 3-5 rondas de purificación. Como se muestra en la Figura 4, todas las placas después de la infección con lisado celular derivada de una placa pura con el virus vaccinia mutante presentaron una señal de RFP. Para verificar si el mutante pura VV tenía la modificación del gen correcto, la PCR se usa para confirmar la ausencia del gen de N1L específica, como se muestra en la Figura 5. PCR del virus modificado mostró una señal positiva para RFP y una señal ausente por N1L ( Figura 5 carril AG), mientras que los resultados de la PCR de N1L para el virus de control (CTR) con una región N1L intacta es positivo. Los fragmentos de ADN de control de A52R fueron positivos para todos los virus recombinantes y el virus Ctr. La eficiencia de recursos humanos en las placas de RFP-positivo es 100% (6/6) en este experimento (que era hasta un 94% en el trabajo previo 34). El método descrito en la presente memoria ha mejorado la eficiencia de recombinación en más de 100 veces en comparación con los protocolos convencionales 33, 34. contenido &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Figura 1:. El casete del vector lanzadera de donante para la recombinación homóloga, y la región objetivo en el genoma VV La purificación RFP gen marcador es impulsado por el promotor H5. El vector de la reparación de los donantes centrarse en esta región N1L resultados en el gen RFP está incorporando en la región N1L después de la recombinación homóloga. &quot;X&quot; indica la secuencia homóloga en el vector donante de reparación que reemplazará a la misma secuencia en el genoma del virus vaccinia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Figura 2:. Obtención de imágenes de un día las células CV-1 después de la recombinación homóloga Un día faetr recombinación homóloga, las células infectadas con VV y transfectadas por el vector donante de reparación son RFP-positivas A:. Imagen de microscopía de fluorescencia (aumento original 100X): B imagen de contraste de fase (100X aumento del original).. Barra de escala = 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Figura 3:. Una placa RFP-positivo en el primer purificación ronda de virus mutante En la purificación de primera ronda del virus mutante, la placa RFP-positivo (en el círculo con la línea roja) con la supresión región diana están rodeados por placas formadas por imagen de contraste de fase (aumento original 100X) B:: Un virus de tipo salvaje (en el círculo con la línea amarilla).. micr fluorescenciaoscopy imagen (100X aumento del original). Barra de escala = 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Imagen de microscopía de fluorescencia (aumento original 100X): B Fase contraste de la imagen (aumento original 100X):. Figura 4:. A El mutante pura VV Después de 3-5 rondas de purificación, placas puras se obtiene como todas las placas se RFP-positivo. . Barra de escala = 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Figura 5: Verification de la pura mutante VV. Se extrajo ADN de las células infectadas por VV CV-1. La supresión de la región diana N1L se verificó mediante PCR utilizando cebadores N1L, la inserción de RFP en región N1L se confirmó mediante PCR usando los cebadores de RFP. Lanes AF corresponden a seis placas purificadas, carril G es una placa de control con N1L eliminación verificada en el trabajo anterior 33, carril Ctr (control) es el virus vaccinia de tipo salvaje (con la región N1L intacta). A52R gen se amplificó como el gen de control para todas las muestras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

virus Vaccinia (VV) se ha utilizado ampliamente en la investigación biomédica y la mejora de la salud humana. Este artículo describe un método simple, altamente eficiente para editar el genoma VV usando un sistema de CRISPR-Cas9.

Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

El objetivo general de este experimento es mejorar la eficiencia de la generación de virus vaccinia mutantes mediante el uso de la tecnología CRISPR-Cas9. Este método puede ayudar a crear nuevos vectores virales de vaccinia para la investigación biológica y médica, en particular para la terapia génica y la vacunación. La demostración viral con este método es fundamental, ya que identificar y seleccionar placas positivas es difícil de realizar.La principal ventaja de esta técnica es que mejora notablemente la eficiencia para obtener nuestro mutante del virus vaccinia. A partir de células CV-1 cosechadas, ajuste su concentración a 100.000 células por mililitro. Luego, siembre dos mililitros de la suspensión en cada pocillo de una placa de seis pocillos para la transfección.Al día siguiente, transfecte las células con 0,5 nanogramos del plásmido gRNA-N2 y 0,5 nanogramos del plásmido pSTCas9. Luego, incúbelas durante 24 horas. Veinticuatro horas después, reemplace el medio.A continuación, prepare el virus VVL15. Diluya el virus VVL15 de andamiaje con DMEM hasta obtener 200.000 PFU por mililitro. Luego, agregue 100 microlitros del virus diluido en cada pocillo de las células CV-1 transfectadas.Dos horas después, transfecte las células con un microgramo del vector donador de transferencia para la expresión de HR e incube las células durante 24 horas. Al día siguiente, desprenda las células CV-1 transfectadas utilizando un raspador celular. Luego, recoja la suspensión celular en un criotubo y almacénela a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.Para comenzar la primera ronda de purificación del VV modificado, siembre 15 placas de seis pocillos con 300.000 células CV-1 no modificadas por pocillo. Al día siguiente, descongele la suspensión congelada de células CV-1 transfectadas a 37 grados celsius durante tres minutos y luego vortexee vigorosamente la suspensión durante 30 segundos para lisar las células. A continuación, diluya un microlitro del lisado con tres mililitros de DMEM.Añada medio mililitro de esta dilución a cada pocillo del cultivo de células CV-1 no modificadas. Luego, devuelva las placas al incubador durante dos días. Dos días después, identifique las placas positivas para RFP utilizando un microscopio de fluorescencia.Se pueden observar con un objetivo de 10X. A medida que se identifican, etiquete con precisión las placas por debajo de la placa utilizando un rotulador. Ahora prepare un criovial que contenga 200 microlitros de DMEM sin suero para cada placa positiva que se vaya a recolectar.A continuación, es importante aspirar todo el medio de los pocillos con placas marcadas. Luego, utilizando una pipeta de 200 microlitros ajustada para aspirar 30 microlitros, cargue parcialmente la pipeta con 10 microlitros de medio del criovial y, a continuación, raspe la placa y aspire las células con el volumen restante. Expulse esto en el criovial y repita este procedimiento otras dos veces, dirigiéndose a la misma placa positiva para RFP para recolectar la mayor cantidad posible de células.Almacene las muestras a menos 80 grados celsius o, si se va a realizar inmediatamente la segunda ronda de purificación, congele los crioviales en hielo seco durante 10 minutos. La segunda ronda de purificación del VV modificado se lleva a cabo exactamente como la primera, utilizando las células congeladas de la primera ronda. Sin embargo, se pueden seleccionar más de seis placas positivas para RFP por cada línea positiva para RFP.Repita el proceso de selección hasta que todas las placas formadas a partir de una placa positiva sean positivas para RFP, lo que indica que la placa es pura; este proceso puede requerir de tres a cinco rondas adicionales. Con un día de anticipación, prepare una placa de seis pocillos con medio millón de células CV-1 por pocillo. Al día siguiente, descongele la placa purificada congelada a 37 grados celsius durante tres minutos.Luego, agite en vórtex la placa vigorosamente durante 30 segundos para obtener un lisado. Añada todo el lisado, incluyendo los restos celulares, a un pocillo de células CV-1 e incube la placa durante tres días. No utilice los otros cinco pocillos.Inspeccione las células diariamente bajo un microscopio. Cuando más de la mitad de las células presenten aspecto citopático, recolecte las células infectadas. Idealmente, todas las células deberían mostrar citopatía.Utilice un raspador celular para recoger las células en un tubo de 15 mililitros con medio de cultivo. Luego, haga un pellet de las células a 300g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y continúe utilizando PCR para verificar la modificación del VV mutante, o congele el pellet celular a 80 grados centígrados negativos para hacerlo más tarde.El método descrito mejora la eficiencia de recombinación en más de 100 veces en comparación con los protocolos convencionales. Por ejemplo, se dirigió la modificación del gen VV N1LG. Como se describe, se realizaron co-transfecciones de plásmidos que expresan Cas9 y un ARN-g específico para N1L en las células CV-1 para aumentar su eficiencia en la recombinación homóloga.Un día después de la transfección, se expresó RFP en las células CV-1. A continuación, las células CV-1 fueron infectadas con el lisado completo procedente de la recombinación homóloga. Se observaron placas positivas y negativas para RFP en las células CV-1.Tras el protocolo de purificación, se obtuvo un recombinante puro. Todas las placas tras la infección con el lisado celular derivado de una placa pura con el virus vaccinia mutante presentaron una señal de RFP. Se utilizó PCR para verificar la eliminación del gen diana.El virus modificado mostró una señal positiva para RFP y ninguna señal para N1L, a diferencia del control de N1L intacto. Todos resultaron positivos para el gen no dirigido A52R. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elaborar rápidamente un nuevo vector de virus vaccinia.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 días si se lleva a cabo correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias biomédicas exploraran nuevos vectores virales en el desarrollo de agentes biológicos para el tratamiento y la prevención del cáncer y las enfermedades infecciosas.

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

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Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

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