Separación basada en cromatografía de capa fina de nucleótidos (p)ppGpp aislados de bacterias inducidas por estrés

Comience con extractos de nucleótidos radiomarcados obtenidos de un cultivo bacteriano antes y después de la inducción del estrés.

Bajo estrés, las enzimas bacterianas convierten el trifosfato de guanosina y el difosfato de guanosina en nucleótidos inducidos por el estrés, pentafosfato de guanosina y tetrafosfato de guanosina.

Localice los extractos en una placa de cromatografía de capa fina prerrecubierta con un polímero catiónico como fase estacionaria.

Coloque la placa en una cámara que contenga un tampón como fase móvil, asegurándose de que el líquido permanezca debajo del punto para evitar una difusión temprana.

Permita que el tampón ascienda por acción capilar, separando los nucleótidos cargados negativamente en bandas distintas según su carga y tamaño.

Después del revelado, retire la placa, seque al aire y recorte la parte superior para eliminar los isótopos libres y reducir la señal de fondo.

Exponga la placa a una pantalla sensible a la radiación para detectar la señal radiactiva.

El aumento de los niveles de guanosina tetrafosfato y guanosina pentafosfato después de la inducción del estrés revela cambios dinámicos en el conjunto de nucleótidos de guanosina.

Primero, coloque una placa TLC de celulosa PEI de 20 por 20 centímetros.

Use tijeras para quitar los cinco centímetros superiores y use un lápiz suave para marcar una línea de origen a un centímetro del borde. Aplique una gota de cinco microlitros de cada muestra a la superficie de PEI.

Antes de que la mancha pueda secarse, transfiera la placa a un tanque que contenga una capa de fosfato monopotásico 1.5 molar que sea lo suficientemente poco profunda como para no tocar el punto de la muestra de origen. Cubra el tanque con un sello hermético y permita que el líquido ascienda hasta la parte superior de la hoja recortada de 15 centímetros. Después de esto, retire el cromatograma completamente desarrollado y séquelo al aire a temperatura ambiente.

Cortar y desechar la parte superior del cromatograma que contiene el P32 libre en residuos radiactivos. Use una pantalla de fósforo para exponer las películas audiorradiográficas durante la noche. Al día siguiente, revele la película y use un generador de imágenes de fósforo para capturar y cuantificar la señal verde del fósforo.

Luego, use el software ImageJ para cuantificar los puntos radiactivos.