Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es aislar y digerir las paredes celulares bacterianas para determinar las identidades y fracciones relativas de diferentes neuropéptidos. Utilizando el análisis UPLC, esto se logra lisando primero las muestras bacterianas hirviéndolas en sulfato de ecol de sodio. Después de lavar el SDS, el segundo paso es digerir las muestras con pronasa E para purificar la membrana externa de las bacterias gramnegativas.

A continuación, las muestras se digieren con mease, para solubilizar el peptidoglicano en neuropéptidos individuales. El paso final es reducir los neuropéptidos y ajustar el pH al punto isoeléctrico del neuropéptido. En última instancia, el UPLC se utiliza para separar los neuropéptidos según su tamaño e hidrofobicidad, lo que facilita la cuantificación de características importantes de la pared celular, como el grado de reticulación y la longitud media de la cadena de glicanos.

Este método puede ayudar a revelar las respuestas a preguntas clave en el campo de la microbiología, como las relaciones entre la morfogénesis, la arquitectura de la pared celular, la activación del sistema inmunitario y la patogénesis. Aunque este método se ha desarrollado para purificar el glicano peptidil gramnegativo, también se puede aplicar a las bacterias grampositivas con la adición de algunas enzimas y tratamientos químicos. Para volver a hacer crecer los cultivos bacterianos, diluya los cultivos durante la noche de uno a 100 en 250 mililitros de medios frescos y crezca hasta la densidad óptica deseada a 600 nanómetros mientras crecen los cultivos diluidos. Prepare un baño de agua hirviendo en una placa caliente en un vaso de precipitados de un litro.

Una vez que el agua esté hirviendo, alícuota seis mililitros de sulfato de sodio al 6% o SDS en tubos de polipropileno de 50 mililitros. Agregue una barra agitadora pequeña a cada tubo y apriete firmemente las tapas de los tubos. Coloque los tubos en el baño de agua hirviendo y revuelva a 500 RPM en la placa caliente.

Coseche los cultivos de 250 mililitros girando a 5.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender los gránulos en tres mililitros de medio o en una solución salina tamponada con fosfato. Pipetee lentamente las suspensiones celulares en los tubos de 50 mililitros con SDS de ebullición al 6% para piojos de las celdas mientras los tubos se sumergen en el baño de agua hirviendo y vuelva a cerrar las tapas para que queden apretadas con los dedos.

Tape el baño de agua hirviendo y deje hervir las células durante tres horas, comprobando el nivel del agua periódicamente y rellenando el baño de agua cuando sea necesario. Después de tres horas, apague el fuego en la placa caliente y continúe revolviendo durante la noche a 500 RPM. Si el SDS ha precipitado en los tubos de 50 mililitros durante la noche, ponga el baño de agua a hervir durante una o dos horas más.

Aquí se muestra cómo debería verse un cultivo normal después de la lisis durante la noche. En SDS, observe la transparencia en lugar de la opacidad que se correlaciona con la precipitación. Prepare el tampón prono e y active el prono E a 60 grados centígrados en un bloque de calor durante al menos 30 minutos.

Utilice una ultracentrífuga ajustada a 400.000 veces G para centrifugar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente con el fin de peletizar las grandes moléculas de peptol glicano o macro PG y, por lo tanto, purificarlas de otros componentes celulares. Retire el sobrenadante con cuidado y luego vuelva a suspender cada pellet a temperatura ambiente. El volumen de la suspensión de agua ultrapura depende del volumen de los tubos de ultracentrífuga utilizados.

Utilice un volumen que llene los tubos al menos hasta la mitad, pero que no exceda el volumen máximo de los tubos. Repita la centrifugación y el lavado hasta que el agua no forme burbujas durante la suspensión de Resus, lo que indica que la SDS se ha eliminado por completo en este punto. Resus suspende las muestras en 900 microlitros de tampón tris HCL y las transfiere a dos tubos de mililitros previamente pinchados con agujeros en la parte superior.

Con una aguja pequeña, agregue 100 microlitros de pronasa E activada a cada muestra antes de incubar a 60 grados centígrados durante dos horas. Detenga la indigestión propensa agregando 200 microlitros de 6%SDS a cada muestra y hierva las muestras en el bloque de calor de 100 grados Celsius durante 30 minutos. Como antes, use una ultracentrífuga configurada a 400, 000 veces G para centrifugar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente y lave con agua ultrapura a temperatura ambiente hasta que la SDS se elimine por completo en el último paso de lavado por centrifugación, suspenda las muestras en 200 microlitros de tampón de fosfato de sodio de 50 milimolares.

Este volumen se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de peptoglicano en la muestra y puede depender de la especie. Si la muestra contiene más pep glycan, aumente el volumen de la suspensión. Si la muestra tiene poco péptido glicano.

Reducir el volumen de la suspensión resus a un mínimo de 50 microlitros. Transfiera las muestras a tubos de 1,5 mililitros y agregue un miligramo por mililitro de micase para obtener una concentración final de 40 microgramos por mililitro. Incube durante seis a ocho horas o toda la noche en un bloque de calor de 37 grados centígrados.

Para preparar muestras para UPLC, encienda un bloque de calor a 100 grados Celsius. Hervir las muestras sin SDS durante cinco minutos para detener las muestras de centrífuga de digestión de la malasa durante 10 minutos a 16.000 veces. G a temperatura ambiente.

Los neuropéptidos están ahora en el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a tubos de vidrio de 13 por 100 milímetros. Intenta recuperar la mayor cantidad de sobrenadante posible, acercándote mucho al paladar sin perturbarlo.

Ajuste el pH agregando 500 milimolares de tampón de borato a la muestra para una concentración final de 100 milimolares de tampón de borato, el diámetro de ocho tampones es compatible con el agente reductor. Hidruro de boro de sodio: agregue varios granos de borohidruro de sodio para reducir cada muestra y deje que la reacción continúe durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, ajuste las muestras a pH seis medido con papel indicador de pH con ácido ortofosfórico usando incrementos de 20 microlitros, la muestra debe burbujear en respuesta a la adición de ácido ortofosfórico.

Por lo general, la muestra deja de burbujear cuando se alcanza un pH de seis. A continuación, continúe ajustando las muestras a un pH entre tres y cuatro con ácido ortofosfórico utilizando incrementos de dos microlitros. Filtre la muestra a través de una jeringa de 0,22 micras.

Filtre directamente en el vial A-U-P-L-C. Si un precipitado se ha reformado en las muestras una vez transferidas a los viales UPLC, caliente los viales con varias pasadas a través de una llama. Coloque el vial UPLC en el muestreador automático e inyecte 10 microlitros de cada muestra en el instrumento A-U-P-L-C.

Equipado con una columna UPLC de fase reversa C 18 y un detector de absorbancia configurado para monitorear. Las muestras de 202 a 208 nanómetros se inyectan secuencialmente. Ajuste el flujo a 0,25 mililitros por minuto y utilice un gradiente lineal durante 25 minutos para lograr el 100% de disolvente B y el E secuencial de los neuropéptidos en 30 minutos.

Si se va a utilizar la espectrometría de masas para caracterizar los neuropéptidos después de la UPLC, se deben recoger las fracciones del pico de interés en un colector de fracciones, transferir las fracciones a un tubo de 1,5 mililitros y luego secar las fracciones utilizando un evaporador centrífugo. En este resultado típico de UPLC. La detección a través de la absorbancia UV de 202 a 208 nanómetros en función del tiempo establece un tiempo de retención de neuropéptidos particular.

Se observa una resolución clara entre la mayoría de las especies de neuropéptidos y una fuerte intensidad de señal en todo el espectro, lo que permite analizar el grado de reticulación de la longitud media de la cadena de glicanos y la identidad de los neuropéptidos y sus concentraciones. Aquí se muestra un ejemplo de cromatograma que refleja la precipitación de C de los neuropéptidos. No se aluden picos, lo que da lugar a la ausencia de datos sobre la composición de PG.

La ausencia de picos discernibles en el análisis UPLC puede ocurrir como resultado de una súper concentración de la muestra o un mal ajuste del pH muy por debajo del punto isoeléctrico de los neuropéptidos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días, aunque agitados, se realizaron correctamente siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la espectrometría de masas, se pueden utilizar para identificar positivamente las especies de neuropéptidos en función de la masa después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la función bioquímica de las enzimas clave de la pared celular y el modo de acción de los inhibidores químicos en una amplia variedad de especies y mutantes.