Detección de la expresión de enzimas objetivo en células bacterianas genéticamente modificadas

Empieza con tubos que contienen células bacterianas genéticamente modificadas. Cada bacteria transporta fosmidos de alta capacidad de copia que codifican diversas enzimas.

Incubar los tubos con agitación para facilitar la expresión de diversas enzimas intracelulares.

Añade un sustrato específico a la enzima objetivo al tubo de ensayo y añade un volumen igual de tampón al tubo de control.

Incuba con el sacudido. El sustrato entra en las células, donde las enzimas objetivo lo climen, generando un producto fluorescente.

Carga el tubo de control en un citómetro de flujo precalibrado.

A medida que cada célula pasa por un haz láser, dispersa la luz. Genera un gráfico de dispersión para identificar celdas individuales, que dispersan menos luz que los agrupamientos.

Excluye los grupos celulares y grafica la señal de fluorescencia de las células individuales para establecer la fluorescencia basal.

Coloque el tubo tratado con sustrato en el citómetro de flujo para medir la señal de fluorescencia.

Una señal de fluorescencia aumentada en las células tratadas con sustrato en comparación con las células control confirma la expresión de la enzima objetivo.

Para analizar las enzimas metagenómicas de interés, incubar las células clasificadas a 37 grados Celsius y 200 RPM hasta que el OD₆₀₀ alcance 0,5. Luego añade 1 microlitro de solución de inducción por copia para amplificar el número de copias intracelulares de fosmid.

Tras tres horas a 37 grados Celsius y 250 RPM, se combinan 0,5 mililitros de las células con el sustrato adecuado en un tubo de fondo redondeado de 14 mililitros hasta una concentración final de 100 micromolares. Luego incubar las muestras de control y experimentales a 37 grados Celsius y 200 RPM durante otras tres horas.

Mientras las muestras se mueven, configura los parámetros de la máquina FACS como acabo de demostrar. Luego, añade 5 microlitros de células de cada muestra en tubos individuales de 5 mililitros de fondo redondo que contienen 1 mililitro de PBS. A continuación, carga las celdas de muestra y establece la tasa de eventos entre 1000 y 3000 eventos por segundo.

Crea un gráfico de dispersión de área de dispersión frontal a escala logarítmica frente a área de dispersión lateral a escala logarítmica, y ajusta la compuerta de dispersión R1 para abarcar las células bacterianas del evento singlete. Luego crea un gráfico de dispersión directa a escala logarítmica frente a escala logarítmica en área FITC y establece una puerta de clasificación R2 para que se detecten menos del 0,1% de las celdas negativas. Ahora, carga el tubo de muestra y reajusta la tasa de eventos a 1000 a 3000 eventos por segundo, según sea necesario.