La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

El objetivo general del siguiente experimento es detectar rápidamente la presencia de bacterias específicas como E. coli utilizando sondas genéticas novedosas de gripe, ADN, Zyme Primero, ADN génico completo. Las sondas Zyme se generan por ligadura. A continuación, las bacterias se cultivan para enriquecer el número de moléculas objetivo y se prepara la mezcla extracelular acumulada a partir del sobrenadante.

Luego, la mezcla extracelular cruda se combina con la sonda de ADN Zime, la interacción entre la sonda de DNA Zyme y las moléculas objetivo da como resultado la escisión de la sonda, que luego se utiliza fluorescente. Una interacción del fluorímetro entre la sonda y el objetivo se observa como un aumento en la fluorescencia relativa. A continuación, los resultados se verifican mediante un análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos basados en PCR o anticuerpos es que el procedimiento es más sencillo y fácil de realizar. Aunque este método se ha desarrollado con la bacteria modelo E. coli, se puede aplicar a la detección de cualquier otro patógeno bacteriano o transmitido por los alimentos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es posible que no estén acostumbradas al manejo de sondas de ADN sintético y bacterias. Sergio Aguire, asistente de investigación de mi laboratorio, y Monso Ali, becario postdoctoral de este protocolo, están demostrando el procedimiento.

R-F-D-E-C one es el Zyme de ADN destacado. Consiste en la secuencia catalítica EC uno subrayada en negro y la secuencia de sustrato FS una subrayada en verde contenida dentro del sustrato es un enlace de ARN indicado por la r azul flanqueado por un DT marcado con Fluor indicado por la F y un DT marcado con QUENCHER indicado por la cola RF SS uno es una versión codificada de RFD EEC uno donde la secuencia catalítica EEC uno se mezcla parcialmente en SS uno, pero la parte de FS se mantiene sin cambios. RF DEC one y RF SS one se fabrican mediante ligadura enzimática mediada por plantilla del oligonucleótido FS one con oligonucleótido EC one o SS one en presencia de LT one como plantilla de ligadura para preparar mezclas extracelulares crudas o cems que se utilizarán como objetivo para R-F-D-E-C uno comienza dispensando dos mililitros de LB en tubos de cultivo estériles de 14 mililitros utilizando una pistola de pipetas.

A continuación, con una punta de pipeta estéril, recoja una sola colonia de E. coli de una placa de barrena y colóquela en un tubo de cultivo que contenga lb. Coloque los tubos en una incubadora a 37 grados centígrados y agite a 250 RPM durante 14 horas después de la incubación. Para generar un cultivo de inoculación al 1%re, dispense dos mililitros de LB fresco en tubos de cultivo de 14 mililitros y agregue 20 microlitros del cultivo bacteriano del paso anterior.

Incubar los tubos a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM hasta que cada solución bacteriana alcance un OD 600 de aproximadamente una transferencia. Un mililitro de cada cultivo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y granular las células por centrifugación a 11.000 g durante cinco minutos. Después del centrifugado, transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mililitros.

Almacene el sobrenadante a menos 20 grados centígrados. Si no se va a utilizar inmediatamente para determinar si se genera una señal fluorescente con la interacción de las enzimas del ADN con el extracto de células crudas, las muestras se analizan mediante espectrometría. Encienda el espectrofotómetro fluorescente y configure los parámetros de adquisición de datos con excitación a 488 nanómetros y emisión a 520 nanómetros.

También configure el instrumento para tomar lecturas cada minuto durante una hora. Lave tres cubetas de cristal de cuarzo primero con agua destilada desionizada y luego con etanol al 100%. Seque las cubetas con gas nitrógeno flash.

Etiquete las cubetas como C: uno para el control, C, dos para el control dos y T para la prueba, luego transfiera 24 microlitros de agua destilada desionizada a C, uno y 24 microlitros de la mezcla extracelular cruda de E. coli preparada a C, dos y T. Agregue 25 microlitros de dos X RB a cada Q vet y colóquelos en el espectrofotómetro fluorescente. Comience a recopilar datos de fluorescencia después de cinco minutos, agregue un microlitro de cinco micromolares RFS S uno a C dos y un microlitro de cinco micromolares, RFD eec uno a T y C uno asegurándose de que las lecturas de fluorescencia no se interrumpan. Mezcle cada solución pipeteando, luego deje que la reacción continúe durante el resto del período de adquisición.

Guarde los datos en formato de archivo de Excel. A continuación, transfiera los datos a un ordenador personal y utilice Excel para crear una imagen gráfica. Las mismas mezclas de reacción que se utilizaron para el análisis por Spectra.

La fotometría se puede utilizar para el análisis mediante electroforesis en gel. Después de una hora de adquisición. Retire las cubetas del espectrofotómetro y transfiera las soluciones a nuevos tubos de microcentrífuga.

Apague las reacciones agregando cinco microlitros de acetato de sodio tres molares y 125 microlitros de etanol al 100%. Mezcle cada solución por vórtice y coloque los tubos en un congelador a menos 20 grados centígrados durante una hora después de la centrífuga de incubación. La reacción se mezcla a 11.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y elimina cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.

Seque los gránulos con un concentrador de ADN durante 10 minutos. Agregue 20 microlitros de tampón de carga de gel y brevemente vórtice. Gire brevemente con una centrífuga de sobremesa.

A continuación, cargue 10 microlitros de las muestras de reacción por pocillo de gel 10%Dage después de la ejecución. Retire las placas de vidrio y lávelas bien con agua del grifo. Para eliminar los restos de gel, limpie las placas con una toallita Kim.

Escanee la placa de gel en busca de fluorescencia con un escáner de tifones. Analice las imágenes resultantes utilizando el software de cuantificación de imágenes para evaluar la sensibilidad del sistema. Los cultivos diluidos en serie se cultivan durante períodos de tiempo cada vez mayores.

Para determinar el período mínimo de incubación requerido para detectar una sola bacteria, prepare 10 tubos de cultivo que contengan dos mililitros de lb, inocule cada cultivo con 100 microlitros de dos UFC por mililitro de un stock de glicerol de E. coli e incube a 37 grados Celsius con agitación a 250 RPM a las 4, 8, 12, 16 y 24 horas. Coseche 300 microlitros de cada uno de los tubos de cultivo inoculados, ya que es posible que no haya bacterias detectables para las muestras recolectadas a tiempo. Puntos 4, 8, 12.

Deje que el cultivo restante crezca durante 24 horas para identificar los cultivos que contienen bacterias. Mida el OD 600 y precipite las células por centrifugación a 11.000 G durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene el CEMS a tubos de microcentrífuga nuevos de 1,5 mililitros y guárdelo a menos 20 grados centígrados hasta que lo use al día siguiente.

Inspeccione los cultivos para ver si crecen. Solo uno o dos de los 10 cultivos pueden contener E. coli después de la inoculación y los tubos restantes no contendrán ninguna célula. Utilice los CEMS recuperados de cultivos positivos en los puntos de tiempo designados Para preparar las reacciones de escisión con RFD EEC one, analice las mezclas de reacción utilizando la electroforesis en gel DAGE como se describió anteriormente, tanto las sondas RFD EEC one como RF SS one se prepararon mediante ligadura enzimática de las porciones de CIMA de ADN al sustrato.

A continuación, se evaluó por espectrometría la interacción de CEM EEC y RFD EEC one o RF SS uno. Como se puede ver aquí. R-F-D-E-C one produjo un alto nivel de señal fluorescente tras la adición de CEM ec.

En marcado contraste, R FS S one no produjo una señal fluorescente fuerte. Por lo tanto, la función productora de fluorescencia de RFD EEC uno. Al ponerse en contacto con CEM, se secuencia la EC.

Específico para verificar que los aumentos de fluorescencia observados se debían a la escisión del enlace del ARN. Las mezclas de reacción se analizaron por escisión de RFD eec, se espera que el hidróxido de sodio de uno por 0.25 molar genere fragmentos de NA 2D, un fragmento de cinco primos que retiene el fluor y un fragmento de tres primos que retiene el extintor. Como se puede ver aquí.

La mezcla de reacción RFD EEC CEM CEC produjo efectivamente el producto de escisión esperado. Además, solo el fragmento R-F-D-E-C uno escindido por UNC y el fragmento de cinco primos pudo detectarse mediante imágenes de fluorescencia. Para examinar la especificidad de RFD EEC, se realizaron ensayos de fluorescencia utilizando CEMS recolectados de varias otras bacterias gramnegativas y grampositivas únicamente.

La muestra que contenía CEM EC produjo un aumento de la fluorescencia. La falta de reactividad cruzada con CEMS de las otras bacterias indica que R-F-D-E-C one es altamente selectivo para E. coli para determinar el tiempo mínimo de cultivo requerido para detectar una sola célula de E. coli E, coli diluida a una UFC, por mililitro en 100 microlitros cultivados con medio de crecimiento durante 4, 8, 12, 16 y 24 horas. El CEMS resultante mezclado con R-F-D-E-C uno y la escisión se evaluó por dage como se muestra aquí.

Una imagen del ensayo de Dage indica que R-F-D-E-C uno no produjo el producto de escisión esperado. Cuando se reaccionó con CEM. El SEC se recoge a las cuatro y ocho horas de crecimiento, lo que indica que se necesita un tiempo de cultivo de 12 horas una vez dominado.

El componente clave de esta técnica es que el ensayo basado en la enzima DA se puede realizar en 60 minutos si se realiza correctamente después de este desarrollo. El procedimiento allanó el camino para que los investigadores en el campo del bioanálisis exploraran las enzimas alogénicas del ADN para la detección de una amplia gama de patógenos bacterianos.