Name: La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a estudiar la interferencia de factores de virulencia bacteriana con señalización intracelular usando sistemas de expresión inducible. Este método permite analizar cascadas de apoptosis en líneas celulares estables mediante western blot.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) a través de la Iniciativa de Investigación Colaborativa 796 (SFB796) a A.L. y C.B., y a través de la3ª convocatoria de ERA-NET PathoGenoMics a A.L.

1. Generación de líneas celulares estables que expresan la proteína de interés <ol><li> Preparar los medios de comunicación mediante la adición de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina / estreptomicina al comercialmente disponible Dulbecco medio Eagle modificado (DMEM) suplementado con GlutaMAX-I, el piruvato, y 4,5 g / L de D-glucosa. </li><li> Cultivar las células HEK293 en medios a 37 ° C en 5% de CO 2. Sub-cultivar células cada tercer día. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 15 ml de medio fresco. Pipeta 1 ml en un nuevo 75 cm 2 frasco de cultivo celular y añadir 14 ml de medio. </li><li> Analizar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Semilla células HEK293 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células por pocillo y se incuban durante 24 horas. </li><li> Para la transfección utilizar el protocolo proporcionado por el fabricante del reactivo de transfección. Transfectar células con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizando el reactivo de transfección. Antes de su uso, calentar el reag transfecciónent y los medios necesarios para RT. Utilice una proporción de 3: 1 de reactivo de transfección con el ADN. <ol><li> En detalle, pipeta 1,5 l de reactivo de transfección directamente en 50 l de medio DMEM libre de suero. Para la formación del complejo, una pipeta 0,5 g de ADN que codifica GFP o GFP-CAEB a la mezcla que contiene el reactivo de la transfección y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Transfectar células mediante la adición de la mezcla de reacción de una manera gota a gota y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol></li><li> Añadir 1 mg / ml de geneticina para la selección de clones GFP-positivas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Después de 6 días, aislar células individuales mediante citometría de flujo de clasificación en una placa de 96 pocillos que alberga medio y HEK293 sobrenadante en una relación 1: 1. Generar HEK293 sobrenadante de las células HEK293 confluentes cultivadas que se centrifugaron durante 15 min a 4966 x g. </li><li> Al día siguiente, reemplazar medio de cultivo con medio que contiene 1,50; mg / ml de geneticina. Cambie los medios una vez por semana. Si las células forman una monocapa confluente, transferirlos a una placa de 24 pocillos. Sub-cultivar las células dos veces a la semana en una proporción de 1: 5 en medio que contenía 1,5 mg / ml de geneticina. Por último, analizar el porcentaje de células positivas para GFP mediante análisis de inmunotransferencia y citometría de flujo. </li></ol> 2. Análisis de líneas celulares estables mediante análisis de inmunotransferencia <ol><li> Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C. </li><li> Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x. </li><li> Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0.45 m) a un voltaje constante de 16 V durante 60 min utilizando una célula de transferencia Semi-Dry Trans-Blot SD. </li><li> Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT. </li><li> Diluir 4 l de anticuerpo anti-GFP en 4 ml de MPT e incubar las membranas O / N a 4 ° C. </li><li> Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20. </li><li> Incubar membranas con 0,8 l de conjugados con peroxidasa de rábano picante anticuerpos secundarios en 4 ml de MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 2.6) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. </li></ol> 3. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo. <ol><li> Resuspender las células en PBS. Utilice células HEK293 como control negativo para ajustar hacia adelante scatter (FSC) y dispersión lateral (SSC), de modo que las células están en escala. Dibuja una puerta en las células vivas mediante la exclusión de dobletes de células, agregados y restos celulares. </li><li> Ajuste el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas están en el extremo izquierdo del histograma para el canal FL1 (láser de argón de 488 nm). </li><li> Para analizar la intensidad de fluorescencia de las células HEK293-GFP y HEK293-GFP-CAEB abrir el histograma del canal FL1 y adquirir 10.000 eventos en la población cerrada. </li><li> Analizar los datos mediante FACS comerciales de software de análisis. </li></ol> 4. La transfección de la línea celular estable con el sistema de vector de expresión inducible <ol><li> Células de semillas HEK293 que expresan establemente GFP o GFP-CAEB en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 x 10 5 células / pocillo. </li><li> 19 horas después de la siembra, co-transfectar las células con plásmido regulador y plásmido respuesta sea que codifica Bax o caspasa 3 activada. <ol><li> Co-transfectar las células HEK293 establescon 100 ng de plásmido regulador pWHE125-P (Figura 2) y 100 ng de los plásmidos de respuesta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) y 0,4 l de polietilenimina. </li><li> Preparar el ADN y reactivo de transfección polietilenimina cada uno en 75 l de medio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min a TA. Para la formación del complejo, incubar ambas mezclas juntos durante 15 min a TA. </li></ol></li><li> Añadir la solución de polietilenimina / DNA gota a gota a las células y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 5. inducción de la apoptosis <ol><li> 5 horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas pro-apoptóticas mediante la adición de 1 mg / ml de doxiciclina al medio de cultivo. Se incuban las células durante 18 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li></ol> 6. Análisis de Host Cell Apoptosis por análisis de inmunotransferencia <ol><li> Inspeccione las células antes de harvesting bajo el microscopio óptico para comprobar la inducción de muerte celular. Las células apoptóticas son detectable por la presencia de cuerpos apoptóticos que rodea la célula moribunda. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar las células adheridas una vez con PBS caliente. Resuspender las células en 100 l de tampón de muestra 2x Laemmli, el calor durante 5 minutos a 95 ° C y se almacena a -20 ° C. </li><li> Cargar aproximadamente 4 x 10 4 células por muestra en un gel de SDS-PAGE 12%. Además, la carga de 6 l de una escalera proteína comercial como un marcador de peso molecular. Ejecutar geles en un sistema de electroforesis en gel en un voltaje constante de 180 V durante 45-60 min con tampón de Laemmli 1x. </li><li> Proteínas Blot a membranas de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras) en una tensión constante de 16 V durante 60 minutos usando una célula de transferencia semi-seco Trans-Blot SD. </li><li> Membranas bloque en 10 ml de leche en polvo desnatada al 5% en PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) para 1 hr a RT. </li><li> Diluir 4 μl de poli anticuerpo anti-escindido ADP-ribosa polimerasa (PARP) en 4 ml de MPT e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Realizar tres etapas de lavado 10 min con 10 ml de PBS / 0,05% de Tween 20. </li><li> Incubar membranas con 0,8 rábano anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa mu l diluido en 4 ml MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7) y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial según el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para el desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. </li><li> Retire anticuerpos unidos por 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Después de tres lavados con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7), sondear las membranas con 4 l de anticuerpo anti-actina en 4 ml de MPT O / N a 4 ° C. </li><li> Después de tres etapas de lavado con MPT (como se describe en 6.7), se incuban las membranas con 0,8 l de hoanticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa rseradish diluidas en 4 ml de MPT. </li><li> Después de 1 h de incubación a TA, lavar las membranas tres veces con PBS / 0,05% de Tween 20 (como se describe en 6.7 y detectar la actividad de peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Aplicar equipo estándar para desarrollo de la película para visualizar las bandas de proteínas. Nota: Todas las etapas de incubación se realizaron en un agitador de placas durante el tiempo indicado y la temperatura. </li></ol>

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<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneity+and+long-term+stability+of+tetracycline-regulated+gene+expression+with+low+basal+activity+by+using+the+rtTA2S-M2+transactivator+and+insulator-flanked+reporter+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors.</a> Gene. 327 (1), 61-73 (2004).</li>
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<li>Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Tet-responsive+promoters+with+minimized+background+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression.</a> BMC Biotechnol. 10, 81(2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchas bacterias patógenas albergan sistemas de secreción para secretar o translocar proteínas efectoras bacterianas en la célula huésped. Estas proteínas efectoras tienen la capacidad de modular los procesos y vías en la célula huésped, permitiendo que las bacterias para sobrevivir y replicarse dentro de su respectivo nicho intracelular. La comprensión de las actividades bioquímicas y los mecanismos moleculares de las proteínas efectoras ayudará a una mejor comprensión de la patogenicidad y puede ayudar a desarrollar n...

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas 1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante para muchos patógenos intracelulares, y una serie de proteínas efectoras que modulan la apoptosis se han identificado 2-9. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos de actividad sigue siendo difícil en muchos casos. Apoptosis, una forma de muerte celular programada, juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección 10. Dos vías principales que conducen a la apoptosis tienenhan identificado: la orientación de la mitocondria (apoptosis intrínseca) o transducción directa de la señal a través de receptores de muerte celular en la membrana plasmática (apoptosis extrínseca). La vía de la muerte celular intrínseca o mediada por mitocondrias se activa por señales intracelulares e implica la activación de Bax y Bak, dos miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2. Esta familia se compone de proteínas reguladoras pro-y anti-apoptóticos que controlan la muerte celular 11-14. La activación de la apoptosis conduce a la oligomerización de Bax y Bak seguidos por subsiguiente permeabilización de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en la liberación del citocromo C en el citoplasma. La liberación del citocromo C inicia la activación de las caspasas efectoras 3 y 7 a través de la activación de la caspasa 9 en el apoptosome 15. Esto conduce a la proteolisis de sustratos seleccionados que, entre otros, los resultados en la exposición de fosfatidilserina en la superficie celular 16 y libera una DNasa dedicado que fragmenta chromatin 17,18. Con el fin de determinar dónde dentro de la cascada apoptótica una proteína efectora individuo interfiere, un sistema de expresión inducible se empleó 19. Los sistemas de regulación para la expresión condicional de transgenes han sido una herramienta muy valiosa en el análisis de la función de una proteína dentro de la célula o su importancia para el tejido, órgano y desarrollo del organismo, así como durante la iniciación, progresión y mantenimiento de la enfermedad 20-23. Típicamente, los sistemas de control inducibles, tales como el sistema Tet 24 empleado aquí, forman una unidad de transcripción artificial (véase la Figura 1). Uno de los componentes es un factor de transcripción diseñados artificialmente llamada tTA (activador de la transcripción dependiente de tetraciclina), formado por la fusión del represor de la transcripción bacteriana TetR 25 a un dominio de proteína de mamífero que media la activación transcripcional o silenciar 24,26. El segundo componente es un híbridopromotor, denominado TRE (elemento sensible a la tetraciclina), que consiste en un promotor mínimo eucariota, que contiene al menos una caja TATA y un sitio de iniciación de la transcripción, unido a múltiples repeticiones del sitio de unión al ADN cognado para TetR, tetO 24,25. El tercer componente es el ligando natural de TetR, tetraciclina o uno de sus derivados, tales como anhidrotetraciclina o doxiciclina 25. Después de la adición de ligando al medio de cultivo, TetR pierde su afinidad por tetO y se disocia de la TRE. Como resultado, la transcripción del gen diana es abolida. La expresión del transgen puede, por lo tanto, ser estrechamente controlada de una manera tiempo y dependiente de la dosis, tanto en cultivos celulares y en animales 20,23,24. Con tTA, la expresión del transgen se produce constitutivamente, excepto en la presencia de una tetraciclina. Esto puede ser una desventaja en el estudio de proteínas citotóxicas o oncogénicos porque tetraciclina tiene primero que ser eliminado del sistema, antes de expressio transgénn se produce y los efectos de la proteína diana en la célula puede ser monitoreado. Esto puede llevar mucho tiempo y no siempre es completa, especialmente en animales transgénicos 27. Para abordar esta limitación, se usó un mutante TetR con una respuesta inversa a la presencia de doxiciclina para generar un nuevo factor de transcripción, rtTA (inversa tTA) 28. Sólo se une a la TRE y, concomitantemente, activa la transcripción en presencia de doxiciclina. Leakiness residual del sistema, es decir., La expresión del transgen en ausencia de factor de transcripción unido a la TRE, originando ya sea (i) a partir de los efectos de posición en un sitio de integración genómica, (ii) de la propia TRE 29, o (iii) de la no específico de unión de tTA / rtTA 28, fue abordado mediante la introducción de un silenciador transcripcional adicional, denominado TTS (silenciador transcripcional dependiente de tetraciclina) 30 al sistema. Se forma una red regulador dual junto con rtTA (véase la Figura 1).En ausencia de doxiciclina, TTS se une a TRE y activamente apaga cualquier transcripción restante. En presencia de doxiciclina, TTS se disocia de TRE y ata el rtTA inducir simultáneamente la expresión del gen diana. Esta capa adicional de rigor es a menudo necesario para expresar proteínas citotóxicas altamente activos 31-34. Usando este sistema de doble regulador estrechamente controlada, la cascada apoptótica puede iniciarse en una etapa definida que permite el análisis de si la proteína efectora dado puede interferir con la inducción de apoptosis. Este método no sólo se puede utilizar para estudiar la actividad anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas sino también para la expresión inducible de proteínas pro-apoptóticas o tóxicos, o para la disección de la interferencia con otras vías de señalización.

<table><tbody><tr><td>Tecnologías de vida DMEM</td><td></td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida</td><td>de pluma/estreptococo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr>Tecnologías de <td>vida</td><td>OptiMEM</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escalera de proteínas preteñida</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFMillipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>PARP anti-escisión</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>IgG de ratón (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>IgG de conejo (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Sustrato de Western Blotting</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de decapado Western Blot Restore Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

la aplicación de un sistema de expresión inducible para el estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con señalización intracelular

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

La técnica presentada aquí permite analizar en qué etapa una proteína diana, o, alternativamente, una molécula pequeña, interactúa con los componentes de una vía de señalización. El método se basa, por un lado, en la expresión inducible de una proteína específica para iniciar un evento de señalización en un paso definido y predeterminado en la cascada de señalización seleccionado. Expresión concomitante, por otro lado, del gen de interés, luego permite al investigador evaluar si la actividad de la proteína diana expresada se encuentra aguas arriba o aguas abajo del evento de señalización iniciada, dependiendo de la lectura de la vía de señalización que se obtiene. Aquí, la cascada apoptótica fue seleccionado como una vía de señalización definido para demostrar la funcionalidad de protocolo. Las bacterias patógenas, tales como Coxiella burnetii, translocación de proteínas efectoras que interfieren con la inducción de la muerte de la célula huésped en la célula huésped para asegurar la supervivencia bacteriana en la célula y para promover sudifusión en el organismo. El C. proteína efectora burnetii CAEB inhibe eficazmente la muerte de la célula huésped después de la inducción de la apoptosis con luz UV o con estaurosporina. Para reducir a la que paso CAEB interfiere con la propagación de la señal apoptótica, proteínas seleccionadas con actividad pro-apoptótica bien caracterizado se expresaron transitoriamente de una manera doxiciclina inducible. Si CAEB actúa aguas arriba de estas proteínas, la apoptosis se procederá sin obstáculos. Si CAEB actúa aguas abajo, se inhibirá la muerte celular. Las proteínas de prueba seleccionadas fueron Bax, que actúa a nivel de la mitocondria, y la caspasa 3, que es la principal proteasa ejecutor. CAEB interfiere con la muerte celular inducida por la expresión de Bax, pero no por la caspasa 3 expresión. CAEB, por lo tanto, interactúa con la cascada apoptótica entre estas dos proteínas.

En primer lugar, se establecieron líneas de células HEK293 que expresan establemente la proteína de interés (CAEB) como una proteína GFP-fusión. Como control, también se generaron líneas de células HEK293 que expresan establemente GFP. La expresión de GFP y GFP-CAEB se verificó mediante análisis de inmunotransferencia. El representante de inmunotransferencia (Figura 4A) demuestra la expresión estable y claramente detectable de GFP y GFP-CAEB. Sin embargo, este ensayo no puede determinar si todas las cél...

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la interferencia de factores de virulencia bacterianos con la señalización intracelular. Esto se logra estableciendo líneas celulares estables que expresan la proteína de interés para estudiar su actividad a nivel celular masivo. Como segundo paso, se crea un sistema de vector de expresión inducible, que permite activar una cascada de señalización en la célula huésped en una etapa definida. A continuación, se analizará si la proteína de interés puede interferir con la activación de la cascada de señalización en la célula huésped, con el fin de delimitar el punto de acción de la proteína de interés. Los resultados muestran que el factor de virulencia Cozy Yellow Burnett, KAB, interfiere con la cascada apoptótica en una posición posterior a Backs y anterior a la activación de Cascada Tres, según el análisis mediante inmunotransferencia (western blotting).Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología infecciosa, como identificar el paso clave en una cascada de transducción de señales en el que interfiere una proteína efectora bacteriana determinada. Esto no solo nos ayudará a comprender mejor cómo los microorganismos patógenos manipulan a sus huéspedes, sino también cómo funcionan estos procesos celulares básicos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las estrategias bacterianas para prevenir la muerte celular apoptótica, también puede aplicarse a otros sistemas de transducción de señales en el campo de la muerte celular, como la necroptosis o la piroptosis, o también a redes de señalización implicadas en la proliferación celular, la regulación génica o las respuestas del sistema inmunitario.Stephanie Besler, estudiante de posgrado del laboratorio de Mann, demostrará este procedimiento. Comience este procedimiento sembrando células HEK 293 que expresan establemente GFP o GFP, digamos B, en una placa de 12 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo.A continuación, prepare por separado el ADN y el reactivo de transfección de polietileno en 75 microlitros de medio opti, e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo. Incube ambas mezclas juntas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, agregue la solución de ADN con polietileno gota a gota a las células e incube a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.Cinco horas después de la transfección, induzca la expresión de las proteínas proapoptóticas añadiendo un microgramo por mililitro de doxiciclina al medio de cultivo. A continuación, incube las células durante 18 horas a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono bajo el microscopio invertido. Inspeccione las células para verificar la inducción de muerte celular antes de su recolección.Examine las células apoptóticas inducidas, que son detectables por la presencia de cuerpos apoptóticos. A continuación, retire el sobrenadante y lave las células adheridas. Una vez con PBS tibio, re suspenda las células en 100 microlitros de tampón de muestra 2 x lamby.Luego, caliente durante cinco minutos a 95 grados Celsius y, para su uso posterior, almacene a menos 20 grados Celsius después. A continuación, cargue seis microlitros de un marcador comercial de peso molecular. Luego, cargue aproximadamente 40.000 células por muestra en un gel SDS-PAGE al 12%.Corra los geles en un sistema de electroforesis en gel bajo una tensión constante de 180 voltios durante 45 a 60 minutos con un tampón de marcha x 1. Posteriormente, transfiera las proteínas a membranas de PVDF a una tensión constante de 16 voltios durante 60 minutos. Utilice una celda de transferencia semiseca Trans Blot SD y luego bloquee las membranas en 10 mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente.Diluya siete microlitros de anticuerpo anti-PARP clivado en siete mililitros de MPT. Incube la membrana de PVDF con la solución de anticuerpo durante toda la noche a cuatro grados Celsius. Retire la solución de anticuerpo y realice tres lavados de 10 minutos con PBS al 0,05 % de Tween 20. Incube las membranas con 1,4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación.Lave las membranas tres veces con PBS 0.05% Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa de rábano picante mediante un kit comercial según el protocolo del fabricante. Y utilice equipo estándar para el revelado de películas con el fin de visualizar las bandas proteicas. A continuación, elimine los anticuerpos unidos incubando las membranas con siete mililitros de tampón de eliminación para inmunotransferencia durante 30 minutos a temperatura ambiente tras tres lavados con PBS 0.05% Tween 20, e incube las membranas con cuatro microlitros de anticuerpo anti-actina en cuatro mililitros de MPT durante la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, realice tres pasos de lavado de 10 minutos cada uno sobre las membranas con aproximadamente 10 mililitros de PBS con 0,05 % de Tween 20, luego incube las membranas con 1,4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con PBS con 0,05 % de Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa de rábano picante mediante un kit comercial y utilice equipo estándar para el revelado de películas con el fin de visualizar las bandas proteicas. En este experimento, lisados celulares completos de células HEK 293 GFP y HEK 293 GFP sabe fueron inmunodetectados para GFP a fin de demostrar la expresión estable.El análisis representativo de citometría de flujo de células HEK 293 GFP y células HEK 293 GFP sabe muestra la intensidad de la expresión de GFP. Las células HEK 293 GFP y las células HEK 293 GFP sabe fueron tratadas con cuatro micromolares de esporina durante seis horas para inducir apoptosis intrínseca. La apoptosis se analizó mediante inmunotransferencia con anticuerpo contra PARP escindida, en la cual se observó una disminución del corte de PARP en células HK 293 GFP SA B en comparación con células HK 293 GFP.CB protege contra la apoptosis inducida por bax, pero no contra la apoptosis inducida por la caspasa tres. Al implementar este procedimiento, es importante analizar tantos componentes de la vía de señalización como sea posible para ayudar a identificar el paso de interacción. También es recomendable probar proteínas que se activan tanto en sus estados basal como activado para determinar si la proteína efectora elegida interfiere con la vía en sí o más bien con el paso de activación posterior a este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como silenciamiento génico, eliminación génica, levadura de dos híbridos, precipitación de modificaciones postraduccionales o ensayos de estabilidad proteolítica para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuáles son los mecanismos moleculares exactos que emplean estos efectores microbianos para manipular la fisiología normal de la célula huésped? ¿Y cómo beneficia esto la supervivencia y diseminación del patógeno?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Berens, C. et al. Aplicación de un sistema de expresión inducible para estudiar la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con la señalización intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra el uso de un sistema de expresión inducible para identificar dónde la proteína efectora bacteriana CaeB interrumpe la cascada apoptótica del huésped. Describe los pasos para transfectar células que expresan CaeB con un sistema sensible a la tetraciclina para inducir la expresión...

Transfección de un sistema de expresión génica inducible en células que expresan una proteína efectora bacteriana

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Este video describe el método de regulación de la expresión génica en células cultivadas mediante transfección con un plásmido que contiene un gen de interés y un plásmido regulador. La expresión de este plásmido puede ser controlada por tetraciclina o sus análogos sintéticos, lo que convierte a este sistema en un modelo útil para estudiar la expresión génica regulable.

Sistema regulable Tet-off inducible: un método in vitro para modular la expresión génica en células cultivadas mediante el sistema Tetraciclina-Off

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

El sistema de cocultivo hidropónico descrito soporta plantas intactas con mallas de malla metálica y las convierte en cocultivas con bacterias. El tejido de las plantas, las bacterias y las moléculas secretadas pueden ser recogidas separadamente para análisis de aguas abajo, permitiendo simultáneamente que se investiguen las respuestas moleculares tanto de los huéspedes de la planta como de los microbios o microbios que interactúan.

Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Aprenda a estudiar la interferencia de factores de virulencia bacteriana con señalización intracelular usando sistemas de expresión inducible. Este método permite analizar cascadas de apoptosis en líneas celulares estables mediante western blot.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular (Video) | JoVE Journal

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

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