La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con la señalización intracelular. Esto se logra mediante el establecimiento de líneas celulares estables, que expresan la proteína de interés Para estudiar su actividad a nivel de células a granel como segundo paso, se crea un sistema de vectores de expresión inducible, que permite activar una cascada de señalización de la célula huésped en un paso definido. A continuación, se analizará si la proteína de interés puede interferir con la activación de la cascada de señalización de la célula huésped con el fin de reducir el punto de actividad de la proteína de interés, los resultados muestran que el factor de virulencia de Burnett amarillo acogedor KA B interfiere con la cascada apoptótica aguas abajo de la espalda y aguas arriba de la activación de la cascada tres según el análisis de Western blot.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología infecciosa, como identificar el paso clave en una cascada de transducción de señales en el que interfiere una determinada proteína efectora bacteriana. Esto no solo nos ayudará a comprender mejor cómo los microorganismos patógenos manipulan a sus huéspedes, sino también cómo funcionan estos procesos celulares básicos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las estrategias bacterianas para evitar que ocurra la muerte celular apoptótica, también se puede aplicar a otros sistemas de transducción de señales en el campo de muerte celular, como la ons o la piroptosis, o también a las redes de señalización que están involucradas en la proliferación celular, la regulación génica o las reacciones del sistema inmunológico.

La demostración de este procedimiento estará a cargo de Stephanie Besler, una estudiante graduada del laboratorio de Mann. Comience este procedimiento sembrando HEK 2 93 células que expresen GFP o GFP de manera estable, digamos B en un 12. Placa de pocillo a una densidad de 100.000 células por pocillo.

A continuación, prepare el reactivo de transfección media de ADN y polietileno por separado en 75 microlitros de medio optativo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para la formación de complejos. Incubar ambas mezclas juntas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, agregue la solución de ADN de polietileno gota a gota a las células e incube a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.

Cinco horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas pro apoptóticas mediante la adición de un microgramo por mililitro de doxiciclina al medio de cultivo. Luego incube las células durante 18 horas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% bajo el microscopio óptico. Inspeccione las celdas para detectar la inducción de la muerte celular antes de la recolección.

Examinar las células apoptóticas inducidas, que son detectables por la presencia de cuerpos apoptóticos. A continuación, retire el sobrenadante y lave las células adheridas. Una vez con PBS tibio, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de dos x tampón de muestra lamby.

Luego caliente durante cinco minutos a 95 grados centígrados y para uso posterior almacene a 20 grados centígrados negativos después. Después de eso, cargue seis microlitros de una escalera de proteínas comercial como marcador de peso molecular. A continuación, cargue aproximadamente 40.000 células por muestra en un gel de página con una SDS del 12%.

Haga funcionar los geles en un sistema de electroforesis en gel a un voltaje constante de 180 voltios durante 45 a 60 minutos con un tampón de funcionamiento x laly. A continuación, coloque las proteínas en membranas de PVDF a un voltaje constante de 16 voltios durante 60 minutos. Usando una celda de transferencia semiseca SD trans blot, luego bloquee las membranas en 10 mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente.

Diluir siete microlitros de anticuerpo PARP anti escisión en siete mililitros de MPT. Incubar la membrana de PVDF con la solución de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados. Retirar la solución de anticuerpos y realizar tres lavados de 10 minutos con PBS 0,05%Tween 20, incubar las membranas con 1,4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación.

Lave las membranas tres veces con PBS 0.05%Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa de rábano picante con un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Y aplicar el equipo estándar para el revelado de la película para visualizar las bandas de proteínas. A continuación, retire los anticuerpos unidos incubando las membranas con siete mililitros de tampón de eliminación de Western blot durante 30 minutos a temperatura ambiente después de tres lavados con PBS 0.05%Tween 20, pruebe las membranas con cuatro microlitros de anticuerpo anti actina en cuatro mililitros de MPT durante la noche a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, realice tres pasos de lavado de 10 minutos en las membranas con aproximadamente 10 mililitros de PBS 0.05%Tween 20, luego incube las membranas con 1.4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT Después de una hora de incubación a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con PBS 0.05%Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa del rábano picante con un kit comercial y aplique el equipo estándar para el revelado de la película para visualizar las prohibiciones de proteínas. En este experimento, los lisados de células enteras de células HEK 2 93 GFP y HEK 2 93 GFP sabe fueron inmunoremiados para que GFP mostrara una expresión estable.

El análisis representativo de citometría de flujo de las células sabe HEK 2 93 GFP y HEK 2 93 GFP muestra la intensidad de la expresión de GFP. Las células HEK 2 93 GFP y HEK 2 93 GFP sabe se trataron con cuatro esporas micromolares durante seis horas para inducir la apoptosis intrínseca. La apoptosis se analizó mediante un análisis de inmunotransferencia de PARP escindido en el que se encontró que la escisión de PARP disminuyó en las células B HK 2 9 3 GFP SA en comparación con las células HK 2 93 GFP.

CB protege de la apoptosis inducida por bax, pero no de la apoptosis inducida por caspasa tres. Al implementar este procedimiento, es importante sondear tantos componentes de la vía de señalización como sea posible para ayudar a identificar el paso de interacción. También es bueno probar las proteínas que se activan tanto en su estado fundamental como en el activado para determinar si la proteína efectora elegida interfiere con la vía en sí, o más bien con el paso de activación después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de knockdown, knockout, yeast two, hybrid pull-down, post-translational o de estabilidad proteolítica para responder a preguntas adicionales, como por ejemplo, ¿cuáles son los mecanismos moleculares exactos que emplean estos efectores microbianos para manipular la fisiología normal de la célula huésped? ¿Y cómo beneficia esto la supervivencia y diseminación del patógeno?