La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la interferencia de factores de virulencia bacterianos con la señalización intracelular. Esto se logra estableciendo líneas celulares estables que expresan la proteína de interés para estudiar su actividad a nivel celular masivo. Como segundo paso, se crea un sistema de vector de expresión inducible, que permite activar una cascada de señalización en la célula huésped en una etapa definida. A continuación, se analizará si la proteína de interés puede interferir con la activación de la cascada de señalización en la célula huésped, con el fin de delimitar el punto de acción de la proteína de interés. Los resultados muestran que el factor de virulencia Cozy Yellow Burnett, KAB, interfiere con la cascada apoptótica en una posición posterior a Backs y anterior a la activación de Cascada Tres, según el análisis mediante inmunotransferencia (western blotting).

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología infecciosa, como identificar el paso clave en una cascada de transducción de señales en el que interfiere una proteína efectora bacteriana determinada. Esto no solo nos ayudará a comprender mejor cómo los microorganismos patógenos manipulan a sus huéspedes, sino también cómo funcionan estos procesos celulares básicos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las estrategias bacterianas para prevenir la muerte celular apoptótica, también puede aplicarse a otros sistemas de transducción de señales en el campo de la muerte celular, como la necroptosis o la piroptosis, o también a redes de señalización implicadas en la proliferación celular, la regulación génica o las respuestas del sistema inmunitario.

Stephanie Besler, estudiante de posgrado del laboratorio de Mann, demostrará este procedimiento. Comience este procedimiento sembrando células HEK 293 que expresan establemente GFP o GFP, digamos B, en una placa de 12 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo.

A continuación, prepare por separado el ADN y el reactivo de transfección de polietileno en 75 microlitros de medio opti, e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo. Incube ambas mezclas juntas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, agregue la solución de ADN con polietileno gota a gota a las células e incube a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.

Cinco horas después de la transfección, induzca la expresión de las proteínas proapoptóticas añadiendo un microgramo por mililitro de doxiciclina al medio de cultivo. A continuación, incube las células durante 18 horas a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono bajo el microscopio invertido. Inspeccione las células para verificar la inducción de muerte celular antes de su recolección.

Examine las células apoptóticas inducidas, que son detectables por la presencia de cuerpos apoptóticos. A continuación, retire el sobrenadante y lave las células adheridas. Una vez con PBS tibio, re suspenda las células en 100 microlitros de tampón de muestra 2 x lamby.

Luego, caliente durante cinco minutos a 95 grados Celsius y, para su uso posterior, almacene a menos 20 grados Celsius después. A continuación, cargue seis microlitros de un marcador comercial de peso molecular. Luego, cargue aproximadamente 40.000 células por muestra en un gel SDS-PAGE al 12%.

Corra los geles en un sistema de electroforesis en gel bajo una tensión constante de 180 voltios durante 45 a 60 minutos con un tampón de marcha x 1. Posteriormente, transfiera las proteínas a membranas de PVDF a una tensión constante de 16 voltios durante 60 minutos. Utilice una celda de transferencia semiseca Trans Blot SD y luego bloquee las membranas en 10 mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente.

Diluya siete microlitros de anticuerpo anti-PARP clivado en siete mililitros de MPT. Incube la membrana de PVDF con la solución de anticuerpo durante toda la noche a cuatro grados Celsius. Retire la solución de anticuerpo y realice tres lavados de 10 minutos con PBS al 0,05 % de Tween 20. Incube las membranas con 1,4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación.

Lave las membranas tres veces con PBS 0.05% Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa de rábano picante mediante un kit comercial según el protocolo del fabricante. Y utilice equipo estándar para el revelado de películas con el fin de visualizar las bandas proteicas. A continuación, elimine los anticuerpos unidos incubando las membranas con siete mililitros de tampón de eliminación para inmunotransferencia durante 30 minutos a temperatura ambiente tras tres lavados con PBS 0.05% Tween 20, e incube las membranas con cuatro microlitros de anticuerpo anti-actina en cuatro mililitros de MPT durante la noche a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, realice tres pasos de lavado de 10 minutos cada uno sobre las membranas con aproximadamente 10 mililitros de PBS con 0,05 % de Tween 20, luego incube las membranas con 1,4 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en siete mililitros de MPT durante una hora a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con PBS con 0,05 % de Tween 20, detecte la actividad de la peroxidasa de rábano picante mediante un kit comercial y utilice equipo estándar para el revelado de películas con el fin de visualizar las bandas proteicas. En este experimento, lisados celulares completos de células HEK 293 GFP y HEK 293 GFP sabe fueron inmunodetectados para GFP a fin de demostrar la expresión estable.

El análisis representativo de citometría de flujo de células HEK 293 GFP y células HEK 293 GFP sabe muestra la intensidad de la expresión de GFP. Las células HEK 293 GFP y las células HEK 293 GFP sabe fueron tratadas con cuatro micromolares de esporina durante seis horas para inducir apoptosis intrínseca. La apoptosis se analizó mediante inmunotransferencia con anticuerpo contra PARP escindida, en la cual se observó una disminución del corte de PARP en células HK 293 GFP SA B en comparación con células HK 293 GFP.

CB protege contra la apoptosis inducida por bax, pero no contra la apoptosis inducida por la caspasa tres. Al implementar este procedimiento, es importante analizar tantos componentes de la vía de señalización como sea posible para ayudar a identificar el paso de interacción. También es recomendable probar proteínas que se activan tanto en sus estados basal como activado para determinar si la proteína efectora elegida interfiere con la vía en sí o más bien con el paso de activación posterior a este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como silenciamiento génico, eliminación génica, levadura de dos híbridos, precipitación de modificaciones postraduccionales o ensayos de estabilidad proteolítica para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuáles son los mecanismos moleculares exactos que emplean estos efectores microbianos para manipular la fisiología normal de la célula huésped? ¿Y cómo beneficia esto la supervivencia y diseminación del patógeno?