Name: La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende a realizar un ensayo cromogénico de alto rendimiento para el cribado de enzimas degradadoras de polisacáridos utilizando sustratos CPH e ICB. Este método permite identificar nuevas actividades enzimáticas para la biotecnología en menos de una hora.

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Nos gustaría agradecer al Prof. J. Paul Knox (Universidad de Leeds, Reino Unido), que proporciona acceso a sus laboratorios para el rodaje, y Susan E. Marcus por su excelente asistencia técnica. JS reconoce el proyecto WallTraC (VII Programa Marco de la Comisión Europea (acuerdo de subvención. No: 263916) y la biomasa proyecto de siglo 21 (Innovación fundación Dinamarca, y el caso no .: 103408) SKK está agradeciendo el proyecto SET4Future (Consejo Danés de Investigación Estratégica), la estratégica Bio-Valor fundada por el Consejo danés de Investigación estratégica, el Consejo danés para la Tecnología y la Innovación (Grant Caso nº .: 0603-00522B), y un enfoque de Biología impulsada para comprender la degradación enzimática del complejo polisacárido Sistemas (Grant Caso sin .:. 107279) para la financiación de este trabajo se refleja puntos de vista de los autores sólo la Unión Europea no se hace responsable del uso que pueda hacerse de la información contener el presente documento..

1. ensayo cromogénico con CPH sustratos en un formato de placa de 96 pocillos <ol><li> La activación de la placa de kit de ensayo <ol><li> Activar el filtro de 96 pocillos (que contiene azul CPH-xilano) placa kit de ensayo (Lista de Materiales) mediante la adición de solución de 200 l de activación (obtenido con el kit) en cada pocillo, seguido de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente sin agitación. </li><li> Aplicar vacío usando un colector de vacío (con el bloque espaciador dentro y cualquier estándar, transparente placa de 96 pocillos como una placa de recogida) para eliminar la solución de activación existente. También es posible utilizar una centrífuga a 2700 xg durante 10 min para este paso en lugar del colector de vacío. </li><li> Lavar los sustratos CPH mediante la adición de 100 l de agua estéril y aplicar vacío (o fuerza centrífuga) para eliminar el estabilizador. Repita este paso dos veces más y las placas están ya listos para su uso. </li></ol></li><li> La reacción enzimática NOTA: Siempre incluya amortiguarsolo como control negativo y si es posible enzimas previamente caracterizados como controles positivos. Utilice un número estadísticamente adecuado de recipientes. Los sustratos CPH son estables entre pH 3,0 a 10,0 y el volumen total de solución de enzima final de tampón en cada pocillo no debe exceder de 180 l. extracto vegetal o caldo de cultivo también se pueden utilizar en lugar de solución de enzima purificada. <ol><li> Añadir 150 l 100 mM de tampón de acetato de sodio, pH 4,5 y 5 l solución -cellulase endo (a una concentración final de 1 U / ml) a cada pocillo de la placa de kit de ensayo. </li><li> Coloque la placa de producto (una placa de pocillos claro compatible con el lector de placa de microtitulación) debajo de la placa kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. </li><li> Incubar la placa kit de ensayo a 25 ° C durante 30 min en un agitador horizontal a 150 rpm. NOTA: La mezcla de la reacción en la placa kit de ensayo durante la incubación es crucial para lograr un consistente y reproresultado ducible. CPH sustratos son utilizables hasta 90 ° C. El tiempo de incubación debe ser aumentada hasta 24 hr al probar caldos de cultivo que contienen concentraciones de enzima con sustratos desconocidos CPH. Tenga en cuenta que los tiempos de incubación apropiados dependen de la actividad de la enzima (s), pero en general, si no hay ninguna actividad detectable dentro de 24 horas, es probable que la enzima no se degradará el sustrato ensayado. Una enzima activa está degradando los polisacáridos cromogénicos insolubles del sustrato CPH en oligosacáridos cromogénicos solubles, que son visibles como sobrenadante de color. </li><li> Coloque la placa de producto limpio el interior del colector de vacío con el bloque espaciador interior. </li><li> Coloque la placa kit de ensayo en la parte superior y aplicar vacío (presión negativa máxima de -60 kPa). También es posible utilizar una centrífuga a 2700 xg durante 10 min. NOTA: El filtrado que contiene los oligosacáridos de color como producto de reacción se encuentra ahora en la placa de producto para su posterior análisis 8 </sarriba&gt;. </li></ol></li><li> Detección y cuantificación <ol><li> Compruebe que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa de producto es aproximadamente la misma mediante inspección visual. </li><li> Leer la absorbancia de la placa de recogida a 595 nm para el azul CPH-xilano utilizando un lector de placas. </li><li> Al hacer el análisis de datos, restar los búfer de sólo los valores de control negativo de los valores de los pozos que se añadió una enzima. Calcular el valor medio y el error estándar de las medias (SEM) de los pocillos replicados 8. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo cromogénico con ICB Sustratos en un formato de 96 pocillos <ol><li> La reacción enzimática <ol><li> Añadir el 150 l 100 mM de tampón de acetato de sodio, pH 4,5 y 5 l 31 U / ml endo -xylanase solución a cada pocillo de la placa de kit de ensayo que contiene paja ICB-trigo rojo (concentración final de enzima en el pozo: 1 U / ml) . NOTA: Las placas kit de ensayo (filtro de 96 pocillos plates que contienen sustratos LPI) están fabricados como se describe en la literatura (ver Lista de Materiales). Los sustratos de LPI son estables en tampones con un rango de pH entre pH 3,0 a 10,0. Siempre incluya tampón solo como control negativo, enzimas comerciales como control positivo y el uso de un número estadísticamente apropiado de réplicas. <ol><li> No activar los sustratos de LPI como la placa de sustrato CPH, pero eliminar el estabilizador por lavado tres veces con 100 l de agua seguido por filtración a vacío o centrifugación. </li></ol></li><li> Coloque la placa de producto por debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier fuga potencial de la placa de sustrato durante la agitación. </li><li> Incubar la reacción a 25 ° C con agitación a 150 rpm durante 2 hr. NOTA: Una enzima activa está degradando los polisacáridos insolubles cromogénicos en el sustrato ICB en oligosacáridos solubles, que son visibles en forma de sobrenadante de color. sustratos de LPI son utilizables hasta 90 ° C. La incubación tIME debería incrementarse hasta 24 horas si se utilizan enzimas no purificada como caldos de cultivo. </li><li> Coloque la placa de producto en el interior del colector de vacío con el bloque espaciador interior. </li><li> Colocar la placa kit de ensayo en la parte superior y aplicar vacío (presión negativa máxima de -60 kPa) o usar una centrífuga para filtrar el producto de la placa de kit de ensayo en el pocillo de la placa de producto. NOTA: El filtrado que contiene los oligosacáridos de color como producto de reacción se encuentra ahora en la placa de recogida para su posterior análisis 8. </li></ol></li><li> Detección y cuantificación <ol><li> Compruebe que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa de recogida es aproximadamente la misma mediante inspección visual. </li><li> Leer la absorbancia de la placa de recogida a 517 nm para la paja de trigo ICB-roja usando un lector de placas. </li><li> Al hacer el análisis de datos - restar el tampón - sólo los valores de control negativo de los valores de los pocillos en los que una enzimafue añadido. Calcular el valor medio y el error estándar de las medias (SEM) de los pocillos replicados 8. NOTA: En el caso de la detección de enzimas desconocidas, se sugiere hacer una serie de diluciones con el fin de obtener datos más detallados sobre el rango dinámico de la actividad de la enzima. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li>
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<li>Kračun, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+versatile+chromogenic+substrates+for+high-throughput+analysis+of+biomass-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyclodextrin+glycosyltransferase+into+a+starch+hydrolase+with+a+high+exo-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity.</a> J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).</li>
<li>Nyyssonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+high-throughput+functional+screening+and+next+generation+sequencing+for+identification+of+plant+polymer+decomposing+enzymes+in+metagenomic+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries.</a> Front Microbiol. 4, 282(2013).</li>
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<li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li>
</ol>

Hay dos solicitudes de patentes presentadas que implica el ensayo de sustrato placa CPH 96 pocillos y el ensayo de sustrato ICB 96 pocillos (WO2015036000 y Dinamarca PA 2015 70311).

Estamos utilizando una nueva generación de CPH y ICB sustratos de varios colores que están basadas en colorantes clorotriazina (lista completa de los sustratos de la Tabla 1) dispuesto en un kit de ensayo comercial de diseño personalizado. La digestión enzimática de los sustratos produce productos pequeños, solubles, teñidos que son detectables en la solución de ensayo y se pueden cuantificar usando un lector de placas 9. Este ensayo está diseñado para la evaluación de enzimas endo-actuando y la sensibilidad del ensayo es similar al uso de una azurina reticulado (AZCL) sustratos 10, mientras que otros métodos están disponibles para exo enzimas-actuando 11,12. La limitación de este kit de ensayo se encuentra en la detección de la actividad endo -enzyme, como CPH, así como los sustratos de LPI no son degradables por exo -enzimas muy probablemente debido al impedimento estérico que surge de las moléculas de colorante y el reticulante 8. El ensayo se realiza en un 96-well formato y las reacciones individuales se llevan a cabo en los pocillos. La reacción tiene que ser mezclado en la placa para recibir datos reproducibles. Los sobrenadantes resultantes se filtran en una placa de producto donde la absorbancia de cada pocillo se puede cuantificar utilizando la espectrometría de absorbancia. Los principios básicos y el diseño del ensayo se muestran en la Figura 1. El ensayo consiste en una placa de ensayo (una placa de filtro de 96 pocillos) con los sustratos, y después de la incubación con las enzimas, el sobrenadante se filtra a través en una placa clara y las absorbancias se leen proporcionar una medición semi-cuantitativa de la especificidad y la actividad de la enzima. Se ha demostrado, que este ensayo de selección utilizando sustratos CPH puede también ser utilizado en un formato de placa de agar, en donde los productos de reacción solubles crean un halo de color después de la incubación durante la noche. 8 Los kits de ensayo se pueden utilizar para detectar enzimas purificadas y sus secundarios potenciales actividades como se demuestra enLa Figura 2. Secundarios actividades pueden surgir de una sola enzima y su especificidad promiscua, sino también de un hecho que la muestra analizada es una mezcla de diferentes enzimas y su efecto sinérgico necesita ser estudiado. Adicionalmente, como se ha demostrado en estudios anteriores, que los cócteles de enzimas, la microbiota intestinal 13 y cultura caldos de hongos 8, así como enzima vegetal endógeno y bacterias (datos no publicados) se pueden utilizar como una fuente de enzima. sustratos ICB abordan mezclas complejas de componentes de la pared celular se encuentran a menudo en los procesos industriales de la descomposición de la biomasa. Estos sustratos están diseñados para evaluar la disponibilidad de polisacáridos y proporcionar información acerca de cómo optimizar efectivamente cócteles de degradación para la salida de la degradación más eficiente. Como se ilustra en la Figura 3 CPH y LPI sustratos se pueden utilizar en el lado de detección de la enzima a lado - que revela una gran cantidad de información acerca de una especificidad enzimáticaactividad d tanto en el contexto de el sustrato preferido (CPH) y un complejo de más natural que contiene otros componentes además de el sustrato preferido imitando más a un ensamblaje macromolecular encuentra en la naturaleza (ICB). El uso de múltiples colores permite la detección simultánea de diferentes actividades enzimáticas en contra de varios sustratos que aumenta el alto rendimiento y la multiplicidad del ensayo. Spectra de diferentes tintes se puede resolver mediante regresión lineal simple y en la mayoría de los casos la actividad multi-sustrato se puede observar por inspección visual solo. Un ejemplo simulado de un experimento de este tipo y sus resultados se representa en la Figura 4. Esta caja de herramientas de ensayo y la versatilidad de su aplicación son muy adecuadas para el cribado de primer nivel de las enzimas y los caldos de cultivo con actividades desconocidas. Los aspectos más importantes de este ensayo son su naturaleza de alto rendimiento, de personalización, facilidad de uso y la flexibilidad. Con esto en mente, we cree que este nuevo conjunto de herramientas mejorará en gran medida y acelerar los procesos enzimáticos de detección en aplicaciones industriales, así como aplicaciones académicas.

Las técnicas para extraer genomas y metagenomas se han desarrollado rápidamente en los últimos años, al igual que las estrategias de rendimiento medio y alto para clonar y expresar enzimas recombinantes. Además, los recursos bioinformáticos y los depósitos asociados, como (CAZy)1,2, se han expandido enormemente. Sin embargo, existen considerables desafíos inherentes a la explotación de la diversidad de enzimas microbianas con fines industriales y la determinación empírica de las actividades enzimáticas se ha convertido en un grave cuello de botella. Por ejemplo, se estima que, utilizando los métodos actuales, podemos predecir con seguridad las actividades de no más del 4% de las proteínas dentro de la base de datos CAZy. Aunque existen numerosos métodos para controlar las actividades enzimáticas, todos tienen algunas limitaciones. Existen técnicas bien establecidas basadas en cromatografía combinada con espectrometría de masas para evaluar los fragmentos oligoméricos de las actividades de la glicosilhidrolasa (GH)3,4. Sin embargo, estos enfoques requieren mucha mano de obra y, por lo general, son de bajo rendimiento. Los métodos basados en la medición de azúcares reductores, como el ácido dinitrosalicílico5 y los ensayos de Nelson-Somogyi6, son ampliamente utilizados para evaluar las actividades de la GH. Sin embargo, estos ensayos tienen un rendimiento limitado y pueden ser propensos a reacciones secundarias. Los sustratos polisacáridos cromogénicos individuales, como la azurina reticulada (AZCL), se utilizan ampliamente para la determinación de las actividades enzimáticas, pero comprar todos los sustratos por separado y distribuir manualmente los polvos de sustrato dentro de la placa de ensayo puede ser engorroso y costoso7.
Hemos desarrollado una nueva generación de sustratos de hidrogel polimérico cromogénico (CPH) basados en colorantes de clorotriazina que, cuando se utilizan junto con una placa de filtro de 96 pocillos, forman un sistema de ensayo de alto rendimiento. Se desarrollaron sustratos adicionales de biomasa cromogénica insoluble (ICB) que proporcionan información sobre la disponibilidad de sustratos dentro de mezclas poliméricas complejas, como las que existen en la biomasa lignocelulósica. Cada sustrato se puede producir en uno de los cuatro colores, y los sustratos de diferentes colores se pueden combinar en un solo pozo. En este protocolo se demuestra que esta metodología se puede aplicar a una amplia variedad de polisacáridos y proteínas y el potencial para el cribado de GHs, polisacáridos líticos monooxigenásicos (LPMOs) y proteasas. Se proporcionan protocolos específicos para el uso de placas de 96 pocillos y los resultados representativos ilustran la alta eficiencia de los kits de sustrato CPH e ICB como herramientas para el cribado enzimático.
Una ventaja significativa de los kits de ensayo descritos, independientemente del sustrato, es que los kits están listos para usar dentro de los 15 minutos, después del paso de activación. Esto elimina la necesidad de un ensamblaje lento del ensayo a partir de materiales de sustrato en bruto, como es el caso de algunos otros métodos7. Los sustratos CPH e ICB tienen un excelente almacenamiento (al menos un año a temperatura ambiente), pH y estabilidad de temperatura 8 y no requieren equipo especializado ni capacitación. Los ensayos CPH o ICB se basan en una placa de filtro de 96 pocillos dentro de la cual se lleva a cabo la reacción con la enzima. Si la enzima es activa con un sustrato dado, se generan oligómeros solubles teñidos, produciendo un sobrenadante coloreado que luego se puede filtrar en una placa regular de 96 pocillos transparentes utilizando un colector de vacío o una centrífuga 8. 
Los sustratos se tiñen con colorantes de clorotriazina que absorben en el rango del espectro visible (VIS) y los colores individuales (rojo, azul, amarillo y verde) se pueden resolver mediante regresión lineal si se mezclan diferentes sustratos CPH de diferentes colores en un solo pocillo, y la enzima actúa sobre más de un sustrato. La placa resultante con los sobrenadantes se puede medir utilizando un lector de placas de microtitulación estándar capaz de medir la absorbancia en el rango VIS. La mezcla de diferentes sustratos con diferentes colores en un pocillo aumenta el rendimiento del sistema de ensayo, a un total de 384 experimentos en una placa de 96 pocillos (4 sustratos diferentes de diferentes colores por pocillo).
< clase p = 'jove_content'>Los sustratos CPH proporcionan una herramienta valiosa para evaluar la actividad específica de una enzima, mientras que los sustratos ICB se utilizan para evaluar la capacidad de una enzima para digerir un componente dentro del contexto de mezclas de sustratos complejas que las enzimas generalmente encuentran dentro de la biomasa. Aunque los sustratos de ICB no proporcionan información sobre las especificidades de las enzimas individuales, son herramientas útiles para evaluar el rendimiento comercial de enzimas, cócteles o caldos.

<table><tbody><tr><td>placas del kit de ensayo</td><td>Glycospot</td><td></td> Solución <td>de activación de placas del kit de ensayo personalizado</td></tr><tr><td></td><td>Glycospot</td><td></td><td>para activar sustratos CPH</td></tr><tr><td>Placa receptora de 350 ml Bloque espaciador para colector de vacío</td><td>Bloque espaciador</td><td>Pall Corporation</td><td>5015</td></tr><tr><td>Placa filtrante MultiScreen HV de 96 pocillos, 0,45 y micro; m, transparente, no estéril Placa de</td><td>ensayo</td><td>Millipore</td><td>MSHVN4510</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 pocillos, polipropileno</td><td>Placa de recogida Greiner Bio-651201 One después del</td><td></td><td>lavado de los sustratos</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Microplacas de 96 pocillos Placa de</td><td>producto</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td></tr><tr><td>Bomba de diafragma MZ 2 NT</td> Bomba de vacío <td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>utilizada con el colector</td></tr> <tr>de vacío<td>Infors HT Ecotron</td><td>Infors HT</td><td>4950132 (Buch & Holm)</td><td>agitador horizontal</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>Lector de absorbancia de placas de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Colector de vacío</td><td>Pall Corporation</td><td>5017</td><td>Colector de vacío</td></tr><tr><td>endo celulasa (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>celulasa [cel]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BMACJ</td><td>mannanase [hombre]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,3-glucanasa (Trichoderma spp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-LAMSE</td><td>&beta;-glucanasa [glu]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-D-galactanasa (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-EGALN</td><td>galactanase [gal]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-xilanasa M4 (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazima</td><td>E-XYAN4</td><td>xilanasa [xyl]</td></tr><tr><td>endo-xiloglucanasa (GH5) (Paenibacillus sp.)&nbsp;</td><td>Megazima</td><td>E-XEGP</td><td>xiloglucanasa [xg]</td></tr><tr><td>&alpha;-amilasa (Bacillus licheniformis)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BLAAM</td><td>amilasa [amy]</td></tr></tbody></table>

la selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-el uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo kits

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

CLos carbohidratos arbohidratos decarbono (CAZymes) tienen múltiples funciones in vivo y se utilizan ampliamente para el procesamiento industrial en las industrias de biocombustibles, textiles, detergentes, papel y alimentos. Una comprensión más profunda de CAZymes es importante tanto desde el punto de vista de la biología fundamental como desde el punto de vista industrial. Existe ungran número de CAZymes en la naturaleza (especialmente en microorganismos) y cientos de miles han sido catalogados y descritos en la base de datos decarbohidratos activos (CAZy). Sin embargo, la tasa de descubrimiento de enzimas putativas ha superado nuestra capacidad para caracterizar bioquímicamente sus actividades. Una de las razones es que los avances en la secuenciación del genoma y el transcriptoma, junto con las herramientas bioinformáticas asociadas, permiten la identificación rápida de los CAZymes candidatos, pero la tecnología para determinar las características bioquímicas de una enzima ha avanzado más lentamente. Para abordar esta brecha tecnológica, aquí se describe un nuevo kit de ensayo de alto rendimiento basado en sustratos cromogénicos insolubles. Se produjeron dos tipos de sustratos distintos: sustratos Polymer Hydrogel (CPH) hromógenos C (hechos a partir de polisacáridos y proteínas purificados) y sustratos C hromógenos Biomass (ICB) insolubles (hechos a partir de materiales de biomasa complejos). Los sustratos CPH e ICB se proporcionan en un sistema de ensayo de alto rendimiento de 96 pocillos. Los sustratos CPH se pueden fabricar en cuatro colores diferentes, lo que permite mezclarlos entre sí y, por lo tanto, aumentar el rendimiento de los ensayos. El protocolo describe un ensayo en placa de 96 pocillos e ilustra cómo se puede utilizar este ensayo para detectar las actividades de las enzimas, los cócteles de enzimas y los caldos.

El alto rendimiento y la capacidad de multiplexación de este ensayo se basa en insoluble polímero cromogénico (o proteína) de hidrogel de sustratos (CPH) dispuestas en placas de filtro de 96 pocillos. Las enzimas, así como controles negativos se añaden a la placa de kit de ensayo (Figura 1A) y las enzimas degradan el correspondiente sustrato producir un sobrenadante de color (Figura 1B). Una vez finalizada la reacción, el sobrenadante se transfiere a una placa de producto bien clara y la absorbancia se puede medir directamente usando un espectrofotómetro adecuado para placas de 96 pocillos (Figura 1C). Un ejemplo de una respuesta a la dosis de CPH-arabinoxilano de xilanasa a diferentes concentraciones de la enzima (0,00-0,75 U / ml) se muestra en la figura 1D donde la concentración de enzima disminución puede observarse visualmente. A quant espectrofotométrico más detalladaficación se puede utilizar para trazar la absorbancia frente a la concentración de enzima (Figura 1E). La intensidad de la señal corresponde a la actividad de la enzima. La reproducibilidad del ensayo se muestra por las barras de error (error estándar de la media, SEM, de tres réplicas). Experimentos más detallados sobre la reproducibilidad de este ensayo se publican en otro lugar 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" /> Figura 1. tratamiento con xilanasa de CPH-arabinoxilano. A) Un esquema de la placa de kit de ensayo con el sustrato CPH (por ejemplo, CPH-arabinoxilano) cargado en pocillos de placas de filtro de 96 pocillos antes de la adición de enzimas 1 y 2 y el tampón el control -sólo (enzima 1 tuvo una actividad -xylanase endo); B) la degradación de CPH-arabinoxilano por la enzima 1 produce un sobrenadante de color; C) a filtrat asistida por vacíoion de los sobrenadantes en a la placa de producto, la absorbancia se mide espectrofotométricamente; D) la placa de producto que contiene los productos de reacción después del tratamiento de CPH-arabinoxilano en 4 colores diferentes con diferentes concentraciones de endo -β-1,4-xilanasa en 100 mM tampón de acetato de sodio, pH 4,5 durante 60 minutos a temperatura ambiente;. E) la cuantificación de los productos de reacción de D utilizando espectrofotometría <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Hay diferentes opciones para el uso de este ensayo en la detección de la enzima. Una opción es el uso de una placa de 96 pocillos que contiene diferentes polisacáridos para la detección, por ejemplo, un pequeño número de (purificada) endo -enzimas con actividad desconocida. En este caso el resultado se muestra que los polisacáridos son Degradcapaz por la enzima diana. Para mostrar este principio, un -cellulase endo se ensayó frente a diferentes sustratos CPH a 25 ° C. Tres concentraciones diferentes de la enzima (0,5 U / ml, 1,0 U / ml y 5 U / ml) se incubaron durante 30 min. El resultado es claramente visible en la placa de producto (Figura 2A). La hoja de producto para este endo -cellulase proporcionado por el proveedor especifica lado a la actividad de xiloglucano (tamarindo), cebada β-glucano, glucomanano, xilano de abedul y del lado de baja actividad económica de galactomanano. En consonancia con esto, se encontró que la actividad adicional a celulasa contra CPH-β-glucano (cebada), CPH-xiloglucano (tamarindo), CPH-xilano (madera de haya) y baja actividad frente a CPH-galactomanano (Figura 2B). El glucomanano no ha sido probado. Los mismos sustratos CPH fueron digeridos con enzimas disponibles comerciales (tres diferentes concentraciones de enzima: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml y 1,0 U / ml) se utilizaron como controles positivos en las mismas condiciones que la anteriorexperimentar. Todos los sustratos fueron degradados por la enzima de control positivo y la intensidad de la señal aumentaron correspondiente a una mayor concentración de enzima (Figura 2C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" /> Figura 2. Ocho diferentes sustratos CPH se incubaron con agitación a 25 ° C durante 30 min. A) La placa de producto de diferentes sustratos CPH digeridos con una endo -cellulase, a diferentes concentraciones. B) Cuantificación de la actividad y varios actividad lado de la endo -cellulase. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres réplicas C) actividad de diferentes enzimas comerciales al sustrato CPH correspondiente (endo-celulasa y 2-HE-celulosa;. E-LAMSE y CPH-paquimano, CPH-curdlano, CPH- β-glucano (cebada); e-XYAN4 y CPH-xilano, e-XEGP y CPH-xiloglucano, E-BLAAM y CPH-amilosa, E-BMACJ y CPH-galactomanano; todas las enzimas de Megazyme). Las barras de error representan el error estándar de la media de las dos réplicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Los biomasa cromogénico (ICB) sustratos insolubles son una adición útil al repertorio sustrato cromogénico, ya que conservan en parte la disposición natural de polisacáridos de las paredes celulares vegetales que son el componente principal de la biomasa. CPH y LPI sustratos se utilizan en nuestro ejemplo para analizar las enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium cuando se cultiva en medio líquido. La configuración de la placa de la placa de kit de ensayo se muestra en la Figura 3A, con 19 CPH sustratos y sustratos 5 de LPI (4 pocillos para cada sustrato, la Figura 3B). P. Chrysosporium fue cultivated durante tres días y luego se analizó el sobrenadante del cultivo. Por lo tanto, 125 l de tampón 200 mM se transfirió a cada sobrenadante de cultivo bien y 25 l añadió. Tres condiciones de pH diferentes se han probado usando tampón de acetato de sodio pH 4,0, tampón de fosfato de sodio pH 6,0 o pH 8,0 (Figura 3C). La placa se incubó agitación (150 rpm) a 25 ° C durante 2 hr. Los productos de reacción se transfirieron a la placa de producto (Figura 3D) y se analizaron. P. chrysosporium produce enzimas para la degradación de diversos glucanos, almidón y xilanos (Figura 3E). las señales más bajas podrían ser detectados para el arabinano hemicelulosas (remolacha azucarera) y galactano péctico, así como para RGI (soja). Las enzimas producidas eran más activos en condiciones ácidas (pH 4,0) que en condiciones neutras o ligeramente básica (pH 8,0). La menor actividad hacia sustratos de LPI (Figura 3F)demuestra que cuando los polisacáridos están en un contexto más natural, la eficiencia de la enzima no es la misma que con un polisacárido puro y es por eso sustratos ICB demuestran una visión más realista en la eficiencia de la enzima, si se aplicó a crudo o pre- material de la planta tratada. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" /> Figura 3. Proyección de un sobrenadante de cultivo de un cultivo líquido de edad de 3 días de Phanerochaete chrysosporium utilizando una placa de sustrato que contiene múltiples CPH 19 y 5 sustratos de LPI. A) Un esquema de la configuración de la placa con 4 pocillos para cada individuo sustrato (fondo gris = sustratos CPH, fondo naranja = sustratos ICB). B) Imagen de la placa de ensayo que contiene el sustrato. C) Esquema que muestra las condiciones de tampón utilizadas en este experimento (Se detectaron 200 mM acetato de sodio pH 4,0, fosfato de pH de sodio 6,0 y fosfato de sodio pH 8,0). D) la imagen de la placa de producto después de 2 horas a 25 ° C. E) absorbancias a 517 nm y se representó para cada sustrato CPH individual y F resultados ICB) de sustrato para las enzimas respectivas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Los sustratos cromogénicos también se pueden utilizar para estudiar los efectos sinérgicos mediante el uso de una mezcla de diferentes sustratos CPH de color en un pocillo y analizar el sobrenadante de reacción después del tratamiento con enzimas individuales o una enzima cócteles. En el siguiente ejemplo se muestra en la Figura 4, rojo CPH-celulosa y sustratos amarillo CPH-xilano se mezclaron juntos en un aproximadamente equal cociente en 96 pocillos pocillos de la placa de filtro. La figura 4A muestra los productos de reacción de color tras el tratamiento 1 hr a temperatura ambiente sin enzima (control), cel celulosa (2 U / ml), xyl xilanasa (1 U / ml) y una mezcla de ambas enzimas (3 repeticiones para cada enfoque) en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,5. Para el análisis, el producto de reacción se cuantificó espectrofotométricamente mediante el escaneo del espectro de absorbancia de 350 nm a 700 nm (Figura 4B). A menudo, la inspección visual solo puede dar una indicación de si la enzima está actuando sobre uno o varios sustratos, sin embargo registró espectros de absorbancia derivados de diferentes tintes también se puede resolver utilizando regresión lineal simple 8 para dar una indicación más precisa de la extensión de la degradación de cada sustrato de la mezcla. El uso de sustratos CPH como mezclas sustancialmente añade al caudal de la prueba, lo que permite screening contra un máximo de 4 sustratos diferentes en un experimento (un bien). En el ejemplo mostrado son cuatro sustratos diferentes utilizados: CPH-β-glucano azul (cebada), amarillo CPH-xilano (madera de haya), verde CPH-amilosa y galactan CPH-pectico rojo (altramuz). El diseño de la placa de sustrato se muestra en la Figura 4C y una imagen de la placa de ensayo en la Figura 4D. La reacción se realizó en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,5 durante 30 min a 25 ° C y 150 rpm. Enzimas individuales en primer lugar con el aumento de la concentración de enzima se probaron con el sustrato correspondiente CPH (Figura 4E) y el sobrenadante de color fue recibido como se esperaba en la placa de producto (Figura 4F, fila 1A - 12D). Fila E contenía las dos diferentes sustratos CPH amarilla CPH-xilano y azul CPH-β-glucano, que se degrada con diferentes proporciones de las correspondientes enzimas endo-glucanasa y endo -xylanase. Después de la reacción, el resultado es visibLe en la placa de producto: el color del producto de reacción era más oscuro, verde y azul, cuando más endo-glucanasa estaba presente (Figura 4F, 4E-6E) y se convirtió en un encendedor de color amarillo-verde, cuando la concentración -xylanase endo aumentó ( Figura 4F, 10-12E). Lo mismo se ve en la fila F, donde los dos sustratos roja galactano CPH-pectico y amarillo CPH-xilano se degradaron con endo -galactanase y endo -xylanase. Los cuatro sustrato CPH color diferente estaban presentes (Figura 4F, 1G-12F) y las enzimas individuales degrada el sustrato CPH apropiado y mediante la adición de enzimas adicionales se recibió una combinación de los productos de reacción de color. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" /> Figura 4. Una combinación de dos sustratos diferentes CPH, rojo CPH-celulosa y amarillo CPH-xilano, tratados con diferentes enzimas. UN) Sobrenadantes de reacción después del tratamiento de dos sustratos con endo -cellulase (cel) o endo -xylanase (Xyl) o ambas enzimas. B) espectros de absorbancia de los sobrenadantes de reacción. Una combinación de cuatro sustratos diferentes CPH tratados con diferentes enzimas C) Esquema de la placa de sustrato que contiene los sustratos CPH:. Azul CPH-β-glucano (cebada), amarillo CPH-xilano (madera de haya), verde CPH-amilosa y CPH- roja galactano péctico (altramuz) D) Imagen de la placa de ensayo que contiene los diferentes sustratos CPH E) Esquema de la placa de producto en la que la relación de las enzimas añadidas (concentraciones nominales (NC):.. glu = 1 U / ml endo-glucanasa, Xil = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amilasa y gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Imagen de la placa de producto después de 30 minutos de incubación a 25 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sustrato </td><td> Fuente </td></tr><tr><td> CPH-2-hidroxietil </td><td rowspan="2"> N / A </td></tr><tr><td> (CPH-2-HE-celulosa) </td></tr><tr><td> CPH-amilopectina </td><td> patata </td></tr><tr><td> CPH-amilosa </td><td> patata </td></tr><tr><td> CPH-arabinano </td><td> remolacha azucarera </td></tr><tr><td> CPH-arabinoxilano </td><td> trigo </td></tr><tr><td> CPH-caseína </td><td> leche bovina </td></tr><tr><td> CPH-quitosano </td><td> origen animal </td></tr><tr><td> CPH-curdlan </td><td> Alcaligenes faecalis </td></tr><tr><td> CPH-dextrano </td><td> Leuconostoc spp. </em&gt; </td></tr><tr><td> CPH-galactomanano </td><td> algarroba </td></tr><tr><td> CPH-laminarina </td><td> Laminaria digitata </td></tr><tr><td> CPH-liquenano </td><td> musgo de Islandia </td></tr><tr><td> CPH-metilcelulosa </td><td> N / A </td></tr><tr><td> CPH-paquimano </td><td> Poria cocos </td></tr><tr><td> galactan CPH-pectico </td><td> patata </td></tr><tr><td> CPH-pululano </td><td> Aureobasidium pullulans </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano I (RG I) </td><td> patata </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano I (Gal) * </td><td> patata </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano </td><td> de soja </td></tr><tr><td> CPH-xilano </td><td> madera de haya </td></tr><tr><td> CPH-xiloglucano </td><td> Tamarindo </td></tr><tr><td> CPH-β-glucano a partir de cebada </td><td> cebada </td></tr><tr><td> CPH-β-glucano de avena </td><td> avena </td&gt; </tr><tr><td> CPH-β-glucano de levadura </td><td> levadura </td></tr><tr><td> ICB-Arabidopsis </td><td> Hojas en roseta de Arabidopsis thaliana Col-0 (planta adulta) </td></tr><tr><td> semillas de Arabidopsis-ICB </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> ICB-bagazo </td><td> Saccharum officinarum (planta adulta seca, tallo y hojas) </td></tr><tr><td> ICB-celulosa cristalina (papel de filtro) </td><td> papel comercial Whatman 3MM Chr Cromatografía </td></tr><tr><td> semillas de alholva-ICB </td><td> Trigonella spp. Semillas </td></tr><tr><td> ICB-cáñamo </td><td> Cannabis spp. (Planta adulta seca, tallo y hojas) </td></tr><tr><td> semillas de altramuz-ICB </td><td> Lupinus angustifolius semillas </td></tr><tr><td> ICB-polen de P. pratense </td><td> Phleum pratense polen </td></tr><tr><td> ICB-abeto </td><td> Picea spp. (Mitronco de un árbol LLED) </td></tr><tr><td> ICB-tabaco </td><td> hojas de Nicotiana benthamiana de (planta joven) </td></tr><tr><td> paja de trigo ICB </td><td> Triticum spp. (Planta adulta seca, tallo y hojas) </td></tr><tr><td> ICB-sauce </td><td> Salix spp. (Planta adulta secado, tronco de árbol molida) </td></tr><tr><td> ICB-Sorgo </td><td> Sorghum spp. (Hojas de la planta adulta) </td></tr><tr><td colspan="2"> (cadenas laterales de β-1,4-D-galactano retirados con endo -β-1,4-D-galactanasa) * </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de cromogénicos disponibles polímero de hidrogel (CPH) y sustratos cromogénicos insoluble Biomasa (ICB).

Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

El objetivo general de este ensayo cromogénico es analizar diversas enzimas en formato de alto rendimiento frente a una selección de diferentes sustratos cromogénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de enzimas, como encontrar nuevas actividades enzimáticas para la degradación de biomasa. La principal ventaja de esta técnica es que los sustratos cromogénicos están disponibles en cuatro colores diferentes, lo que convierte a esta técnica en de alto rendimiento, extremadamente confiable y rentable.Para comenzar, active la placa del kit de ensayo con filtro de 96 pocillos añadiendo 200 microlitros de solución de activación a cada pocillo. Incube a temperatura ambiente sin agitación durante 10 minutos. Utilice una centrífuga y cualquier placa estándar de 96 pocillos para la recolección.Para centrifugar la solución de activación existente, agregue 100 microlitros de agua estéril a los sustratos de hidrogel polimérico cromogénico o CPH y aplique vacío o centrifugue para eliminar el estabilizador. Repita el lavado otras dos veces. Para preparar la reacción enzimática, agregue 150 microlitros de tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 4,5 y 5 microlitros de solución de endo-cellulasa con tres concentraciones diferentes a cada pocillo de la placa del kit de ensayo.Coloque la placa del producto debajo de la placa del kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. A continuación, incube la placa del kit de ensayo a temperatura ambiente en un agitador horizontal a 100 rpm durante 30 minutos. Para obtener datos confiables, es necesario agitar la mezcla de reacción durante la incubación.Coloque la placa del kit de ensayo con la placa de producto debajo en la centrífuga y centrifugue a 2.700 x g durante 10 min para transferir el producto de la reacción a los pocillos de la placa de producto. Después de la centrifugación, inspeccione visualmente la placa de producto para verificar si el volumen de líquido en cada pocillo es aproximadamente el mismo.Utilizando un lector de placas, lea la absorbancia de la placa de recolección a 630 nm para los diferentes sustratos verdes de CPH. Analice y represente gráficamente los datos según el protocolo descrito en el texto. Para realizar el ensayo cromogénico con biomasa cromogénica roja insoluble o paja de trigo ICB, comience añadiendo 200 microlitros de solución de activación en cada pocillo de la placa de ensayo.A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente sin agitación durante 10 minutos. Eliminar el estabilizante lavando los pocillos tres veces con 100 microlitros de agua estéril. Luego, añadir 150 microlitros de tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,5 y 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferentes soluciones de endo-xilanasa.Coloque la placa de producto debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier fuga potencial de la placa de sustrato durante la agitación. Incube la reacción a temperatura ambiente a 100 rpm durante dos horas. Después de la incubación, coloque el kit de ensayo con la placa de producto debajo en la centrífuga y centrifugue a 2.700 x g durante 10 min para transferir el producto de la reacción a los pocillos de la placa de producto.Verifique que el volumen de líquido en cada pocillo sea aproximadamente el mismo. Luego, utilizando un lector de placas, mida la absorbancia de la placa de recolección a 517 nm para el residuo de trigo ICB rojo. Realice el análisis de datos según el protocolo descrito en el texto.Se muestra aquí un ejemplo de la respuesta a la dosis de arabinoxilano CPH frente a xilanasa a diferentes concentraciones de la enzima, en el que se puede observar visualmente la disminución de la concentración de la enzima. Se utiliza una cuantificación espectrofotométrica más detallada para trazar la absorbancia frente a la concentración de la enzima. La intensidad de la señal corresponde a la actividad enzimática.En este ejemplo del ensayo utilizado para la selección de enzimas, se evaluó una endo-cellulasa a tres concentraciones frente a diferentes sustratos CPH. Como se observa aquí, se exhibió actividad adicional a la cellulasa para CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano, y se observó baja actividad frente al CPH-galactomanano. Los mismos sustratos CPH fueron digeridos con enzimas disponibles comercialmente que se utilizaron como controles positivos en las mismas condiciones.Los resultados aquí mostrados indican que todos los sustratos fueron degradados en niveles que aumentaron con concentraciones crecientes de enzima. En este experimento, se incluyeron cinco sustratos ICB junto con 19 sustratos CPH para analizar las enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium bajo tres condiciones diferentes de pH. Las enzimas de P. chrysosporium degradaron diversos glucanos, almidones y xilanos.Se podrían detectar señales más bajas para las hemicelulosas arabinano y galactano péctico, así como para RGI. Las enzimas producidas fueron más activas en condiciones ácidas que en condiciones neutras o ligeramente básicas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora, si se realiza adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mezclar la reacción durante la incubación. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del cribado de alto rendimiento exploren nuevas actividades enzimáticas para la biotecnología. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el kit de cribado.

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