La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

El objetivo general de este ensayo cromogénico es examinar varias enzimas en un formato de alto rendimiento frente a una selección de diferentes sustratos cromogénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de enzimas, como la búsqueda de nuevas actividades enzimáticas para la degradación de la biomasa. La principal ventaja de esta técnica es que los sustratos cromogénicos están disponibles en cuatro colores diferentes, lo que hace que esta técnica sea de alto rendimiento, extremadamente confiable y rentable.

Para comenzar, active la placa del kit de ensayo de filtro de 96 pocillos agregando 200 microlitros de solución de activación a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 10 minutos. Utilice una centrífuga y cualquier placa estándar de 96 pocillos para la recolección.

Para centrifugar la solución de activación existente, agregue 100 microlitros de agua estéril a los sustratos de polímero cromogénico, hidrogel o CPH y aplique un vacío o centrifugado para eliminar el estabilizador. Repite el lavado dos veces más. Para preparar la reacción enzimática, agregue 150 microlitros de tampón de acetato de sodio de 100 mM, pH 4,5 y 5 microlitros de solución de endocelulasa con tres concentraciones diferentes a cada pocillo de la placa del kit de ensayo.

Coloque la placa del producto debajo de la placa del kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. A continuación, incubar la placa del kit de ensayo a temperatura ambiente en un agitador horizontal a 100 rpm durante 30 minutos. Para recibir datos fiables, es necesario agitar la mezcla de reacción durante la incubación.

Coloque la placa del kit de ensayo con la placa de producto debajo de ella en la centrífuga y centrifuga a 2.700 x g durante 10 min. Para transferir el producto de reacción a los pocillos de la placa de producto. Después del centrifugado, inspeccione visualmente la placa del producto para verificar si el volumen de líquido en cada pocillo es aproximadamente el mismo.

Con un lector de placas, lea la absorbancia de la placa colectora a 630 nm para los diferentes sustratos verdes de CPH. Analice y trace los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Para llevar a cabo el ensayo cromogénico con biomasa cromogénica insoluble roja o paja de trigo ICB, comience agregando 200 microlitros de solución de activación en cada pocillo de la placa de ensayo.

Luego, incube la placa a temperatura ambiente sin agitar durante 10 minutos. Retire el estabilizador usando 100 microlitros de agua estéril para lavar los pozos tres veces. A continuación, añadir 150 microlitros de 100 mM de tampón de acetato de sodio pH 4,5 y 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferente solución de endoxilanasa.

Coloque la placa de producto debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier posible fuga de la placa de sustrato durante el agitado. Incubar la reacción a temperatura ambiente a 100 rpm durante dos horas. Después de la incubación, coloque la placa del kit de ensayo con la placa de producto debajo de ella en la centrífuga y centrifuga a 2.700 x g durante 10 minutos para transferir el producto de reacción en los pocillos de la placa de producto.

Verifique que el volumen de líquido en cada pozo sea aproximadamente el mismo. A continuación, utilizando un lector de placas, lea la absorbancia de la placa de recogida a 517 nm para la paja de trigo roja ICB. Realizar análisis de datos según el protocolo de texto.

Aquí se muestra un ejemplo de una respuesta a la dosis de CPH-arabinoxilano a xilanasa a diferentes concentraciones de la enzima donde se puede observar visualmente la disminución de la concentración de la enzima. Se utiliza una cuantificación espectrofotométrica más detallada para trazar la absorbancia frente a la concentración de la enzima. Con la intensidad de la señal corresponde a la actividad de la enzima.

En este ejemplo del ensayo utilizado para el cribado enzimático, se probó una endocelulasa a tres concentraciones frente a diferentes sustratos de CPH. Como se observa aquí, se observó actividad adicional a la celulasa para CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano y se observó baja actividad contra CPH-galactomanano. Los mismos sustratos de CPH se digirieron con enzimas disponibles comercialmente utilizadas como controles positivos en las mismas condiciones.

Los resultados muestran que todos los sustratos se degradaron a niveles que aumentaron con el aumento de las concentraciones de enzimas. En este experimento, se incluyeron cinco sustratos ICB con 19 sustratos CPH para analizar las enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium en tres condiciones de pH diferentes. Las enzimas de P. chrysosporium degradaron varios glucanos, almidones y xilanos.

Se pudieron detectar señales más bajas para las hemicelulosas arabinan y galactan péctico, así como para RGI. Las enzimas producidas fueron más activas en condiciones ácidas que en condiciones neutras o ligeramente básicas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mezclar la reacción durante la incubación. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del cribado de alto rendimiento exploren nuevas actividades enzimáticas para la biotecnología. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el kit de detección.