La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits
20 de septiembre de 2016
Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.
El objetivo general de este ensayo cromogénico es examinar varias enzimas en un formato de alto rendimiento frente a una selección de diferentes sustratos cromogénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de enzimas, como la búsqueda de nuevas actividades enzimáticas para la degradación de la biomasa. La principal ventaja de esta técnica es que los sustratos cromogénicos están disponibles en cuatro colores diferentes, lo que hace que esta técnica sea de alto rendimiento, extremadamente confiable y rentable.
Para comenzar, active la placa del kit de ensayo de filtro de 96 pocillos agregando 200 microlitros de solución de activación a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 10 minutos. Utilice una centrífuga y cualquier placa estándar de 96 pocillos para la recolección.
Para centrifugar la solución de activación existente, agregue 100 microlitros de agua estéril a los sustratos de polímero cromogénico, hidrogel o CPH y aplique un vacío o centrifugado para eliminar el estabilizador. Repite el lavado dos veces más. Para preparar la reacción enzimática, agregue 150 microlitros de tampón de acetato de sodio de 100 mM, pH 4,5 y 5 microlitros de solución de endocelulasa con tres concentraciones diferentes a cada pocillo de la placa del kit de ensayo.
Coloque la placa del producto debajo de la placa del kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. A continuación, incubar la placa del kit de ensayo a temperatura ambiente en un agitador horizontal a 100 rpm durante 30 minutos. Para recibir datos fiables, es necesario agitar la mezcla de reacción durante la incubación.
Coloque la placa del kit de ensayo con la placa de producto debajo de ella en la centrífuga y centrifuga a 2.700 x g durante 10 min. Para transferir el producto de reacción a los pocillos de la placa de producto. Después del centrifugado, inspeccione visualmente la placa del producto para verificar si el volumen de líquido en cada pocillo es aproximadamente el mismo.
Con un lector de placas, lea la absorbancia de la placa colectora a 630 nm para los diferentes sustratos verdes de CPH. Analice y trace los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Para llevar a cabo el ensayo cromogénico con biomasa cromogénica insoluble roja o paja de trigo ICB, comience agregando 200 microlitros de solución de activación en cada pocillo de la placa de ensayo.
Luego, incube la placa a temperatura ambiente sin agitar durante 10 minutos. Retire el estabilizador usando 100 microlitros de agua estéril para lavar los pozos tres veces. A continuación, añadir 150 microlitros de 100 mM de tampón de acetato de sodio pH 4,5 y 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferente solución de endoxilanasa.
Coloque la placa de producto debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier posible fuga de la placa de sustrato durante el agitado. Incubar la reacción a temperatura ambiente a 100 rpm durante dos horas. Después de la incubación, coloque la placa del kit de ensayo con la placa de producto debajo de ella en la centrífuga y centrifuga a 2.700 x g durante 10 minutos para transferir el producto de reacción en los pocillos de la placa de producto.
Verifique que el volumen de líquido en cada pozo sea aproximadamente el mismo. A continuación, utilizando un lector de placas, lea la absorbancia de la placa de recogida a 517 nm para la paja de trigo roja ICB. Realizar análisis de datos según el protocolo de texto.
Aquí se muestra un ejemplo de una respuesta a la dosis de CPH-arabinoxilano a xilanasa a diferentes concentraciones de la enzima donde se puede observar visualmente la disminución de la concentración de la enzima. Se utiliza una cuantificación espectrofotométrica más detallada para trazar la absorbancia frente a la concentración de la enzima. Con la intensidad de la señal corresponde a la actividad de la enzima.
En este ejemplo del ensayo utilizado para el cribado enzimático, se probó una endocelulasa a tres concentraciones frente a diferentes sustratos de CPH. Como se observa aquí, se observó actividad adicional a la celulasa para CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano y se observó baja actividad contra CPH-galactomanano. Los mismos sustratos de CPH se digirieron con enzimas disponibles comercialmente utilizadas como controles positivos en las mismas condiciones.
Los resultados muestran que todos los sustratos se degradaron a niveles que aumentaron con el aumento de las concentraciones de enzimas. En este experimento, se incluyeron cinco sustratos ICB con 19 sustratos CPH para analizar las enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium en tres condiciones de pH diferentes. Las enzimas de P. chrysosporium degradaron varios glucanos, almidones y xilanos.
Se pudieron detectar señales más bajas para las hemicelulosas arabinan y galactan péctico, así como para RGI. Las enzimas producidas fueron más activas en condiciones ácidas que en condiciones neutras o ligeramente básicas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora, si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mezclar la reacción durante la incubación. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del cribado de alto rendimiento exploren nuevas actividades enzimáticas para la biotecnología. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el kit de detección.
Descripción general
Este artículo describe un ensayo cromogénico de alto rendimiento para la selección de enzimas mediante sustratos multiplexados. El kit de ensayo incluye sustratos de hidrogel polimérico cromogénico (CPH) y biomasa cromogénica insoluble (ICB) para probar endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Selección de enzimas
- Biotecnología
- Ensayos de alto rendimiento
Antecedentes
- El descubrimiento de enzimas es crucial para diversas aplicaciones, incluida la degradación de biomasa.
- Los sustratos cromogénicos permiten el seguimiento visual de la actividad enzimática.
- El ensayo está diseñado para ser confiable y rentable.
- Diferentes sustratos proporcionan una variedad de colores para un análisis mejorado.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para cribar enzimas frente a diversos sustratos.
- Identificar nuevas actividades enzimáticas para la degradación de biomasa.
- Facilitar el cribado de alto rendimiento en la investigación enzimática.
Métodos Utilizados
- Activación de una placa de kit de ensayo con filtro de 96 pocillos con una solución de activación.
- Incubación de las reacciones enzimáticas en condiciones controladas.
- Uso de una centrífuga para la recolección del producto.
- Medición de la absorbancia a longitudes de onda específicas para el análisis de datos.
Resultados principales
- Se observaron actividades enzimáticas para diversos sustratos de CPH e ICB.
- Concentraciones más altas de enzima condujeron a un mayor degradación del sustrato.
- Diferentes sustratos mostraron niveles variables de actividad enzimática.
- Las condiciones ácidas aumentaron la actividad enzimática en comparación con condiciones neutras o básicas.
Conclusiones
- Este ensayo proporciona una plataforma robusta para la selección de enzimas.
- Permite a los investigadores explorar actividades enzimáticas novedosas de manera eficiente.
- El dominio de la técnica permite su ejecución rápida en menos de una hora.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cribado de enzimas de alto rendimiento enfrenta cuellos de botella en la disponibilidad de sustratos y la escalabilidad de los ensayos, lo que limita la caracterización funcional rápida de enzimas activas sobre carbohidratos (CAZimas), críticas para aplicaciones industriales en biocombustibles, textiles y alimentos. Este ensayo cromogénico aborda la brecha tecnológica al permitir pruebas multiplexadas de sustratos con codificación por colores en un formato de 96 pocillos, mejorando la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento de enzimas y apoyando decisiones de avance o interrupción en las líneas de ingeniería enzimática. El método mejora la continuidad traslacional desde la identificación de objetivos hasta la validación similar a la preclínica, al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de actividad en diversos sustratos de polisacáridos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de CAZimas putativas mediante la vinculación de candidatos genéticos con actividad bioquímica sobre sustratos de polisacáridos definidos.
- Valor operativo: Apoya la prueba rápida de hipótesis mediante sustratos CPH con multiplexado por color, aumentando el rendimiento del cribado sin comprometer la fiabilidad de los datos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo mecanicista mediante la cuantificación de la actividad enzimática dependiente de la dosis, lo que ayuda a priorizar objetivos para el desarrollo de enzimas industriales.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Proporciona sustratos cromogénicos insolubles estandarizados (CPH y ICB) que imitan la biomasa compleja, lo que permite evaluaciones de actividad fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante pasos estandarizados de activación, lavado y centrifugación, reduciendo la variabilidad en flujos de trabajo de alto rendimiento.
- Valor de escalabilidad: Compatible con lectores de placas estándar de 96 pocillos y sistemas de manipulación de líquidos, lo que permite su integración en plataformas de cribado existentes para la evaluación de cócteles enzimáticos o caldos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la prueba de la actividad enzimática en condiciones de pH variables, reflejando ambientes de procesos industriales.
- Valor operativo: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la correlación entre la concentración de enzima y la degradación del sustrato en múltiples tipos de biomasa (por ejemplo, paja de trigo, glucanos, xilanos).
- Valor predictivo: Mejora la alineación de biomarcadores traslacionales al identificar patrones de actividad dependientes del pH, críticos para la estabilidad de formulaciones en aplicaciones de detergentes o biocombustibles.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se enmarca dentro del continuo desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de compuestos líder, y apoya la verificación de hipótesis, la aclaración de vías metabólicas y la reducción de riesgos biológicos para enzimas degradadoras de carbohidratos antes de invertir en ingeniería de proteínas o en la ampliación de la fermentación.
- Biología del Descubrimiento: Permite aclarar vías mediante el cribado de la actividad enzimática frente a sustratos polisacarídicos específicos (por ejemplo, CPH-glucano, CPH-xilano) para inferir la especificidad del sustrato y el papel funcional.
- Cribado: Ofrece preparación para ensayos y resultados cuantitativos mediante mediciones de absorbancia a 630 nm (CPH) y 517 nm (ICB), lo que permite comparaciones confiables entre variantes enzimáticas o condiciones.
- Análisis: Proporciona datos de respuesta dosis-dependiente que facilitan el análisis estadístico y la selección de resultados positivos, ayudando a los equipos a clasificar candidatos enzimáticos según su actividad y especificidad.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la evaluación del desempeño enzimático en condiciones industrialmente relevantes (por ejemplo, pH ácido, sustratos de biomasa complejos).
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para cribar bibliotecas de enzimas, caldos o cócteles en múltiples proyectos dentro de las industrias basadas en biotecnología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos positivos mediante la medición directa de la actividad sobre sustratos insolubles y similares al estado nativo.
- Valor operativo: Proporciona estandarización y reproducibilidad mediante volúmenes definidos de reactivos, tiempos de incubación y parámetros de centrifugación, minimizando la variabilidad dependiente del usuario.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la criba rápida de cientos de candidatos enzimáticos, reduciendo el tiempo y costo asociados a ensayos bioquímicos de bajo rendimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante la generación de datos cuantitativos de actividad que orientan las decisiones de avance o interrupción en campañas de ingeniería enzimática.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cinética enzimática y optimización de ensayos cromogénicos para garantizar una preparación precisa del sustrato y un monitoreo adecuado de la reacción.
- Depende del acceso a un lector de placas capaz de mediciones de absorbancia a 630 nm y 517 nm, y de una centrífuga compatible con placas de 96 pocillos para la transferencia del producto.
- Necesita una estandarización entre equipos de las condiciones de tampón (por ejemplo, acetato de sodio pH 4,5) y de los parámetros de incubación (por ejemplo, agitación a 100 rpm) para asegurar la reproducibilidad entre diferentes sitios.
- Implica consideraciones de adaptación al probar sustratos no polisacarídicos, ya que el ensayo está optimizado para enzimas activas sobre carbohidratos y podría requerir modificaciones en el tampón o en el sustrato para otras clases de enzimas.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de evitar la agitación durante los pasos de activación y estabilización, y de confirmar visualmente un volumen de producto igual tras la centrifugación para una interpretación confiable de los datos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
