Preparación del tejido de vejiga de ratón para la visualización de infecciones bacterianas

Comienza con un ratón eutanasiado con la vejiga expuesta, preinfectado con bacterias patógenas.

Las bacterias invaden el urotelio y forman colonias. Al madurar, estas bacterias rompen la célula epitelial e infectan las células circundantes.

Inserta un catéter conectado a una jeringuilla llena de fijador. Introduce poco a poco el fijador para inflar la vejiga y preservar su arquitectura.

Clampea la uretra para conservar el fijador y mantener la forma de la vejiga.

Quita el catéter y luego corta la uretra. Transfiere la vejiga a un fijador fresco e incuba para preservar la estructura.

Divide la vejiga en dos copas de media vejiga para exponer el urotelio y enjuaga con un tampón.

Tiñe con un reactivo a base de metal para mejorar el contraste y luego lava con agua ultrapura.

Deshidrata las secciones usando un gradiente de etanol, seguido de un secado en punto crítico.

Corta cada vaso seco de vejiga por la mitad.

La muestra está ahora lista para el procesamiento posterior y visualizar las interacciones huésped-patógeno.

Una vez que la jeringuilla de punta deslizante de tuberculina tenga fijador, fija un catéter en el extremo, biselando en dirección opuesta a las marcas de la jeringuilla.

Corta el tubo sobrante a 1 o 2 milímetros del extremo de la aguja, cuidando de no exponer la punta. Haz un movimiento con la jeringuilla para eliminar las burbujas y empuja el émbolo para expulsar el aire. Luego llena el catéter con un fijador sobre un tubo de microcentrífuga. Tras anestesiar y sacrificar al ratón, una vez aseguradas las patas, abre la zona pélvica del ratón con fórceps y un par de tijeras quirúrgicas para exponer la vejiga. Aparta con cuidado la grasa adyacente, pero deja la vejiga en su sitio.

Sujeta la jeringuilla con la mano dominante y la aguja apuntando hacia abajo. Sumerja la punta del catéter en lubricante estéril y coloca la punta del catéter en la abertura uretral, manteniendo el cañón de la jeringuilla en un ángulo de 30 a 45 grados sobre el cuerpo del ratón.

Aplica presión hacia abajo con un ligero movimiento en sentido horario e inserta suavemente el catéter en la uretra. Cuando la punta del catéter entra, bisagras la jeringuilla hacia la cola del ratón mientras continúas deslizando el catéter más hacia la uretra hasta que el cilindro de la jeringuilla quede paralelo a la superficie de trabajo. Todo el eje de la aguja del catéter debe entrar en el ratón, posicionando la punta del catéter dentro del lumen de la vejiga. Administra lentamente entre 50 y 80 microlitros de fijador, haciendo que la vejiga se inflle como un globo.

Mantén el catéter en su sitio y levanta ligeramente la jeringuilla, inclinando la punta hacia arriba. Con la otra mano, abre un hemostático y desliza una punta bajo la aguja del catéter en la intersección de la uretra. Cierra parcialmente el hemostático hasta que toque la aguja.

Desliza suavemente la aguja del catéter fuera de la vejiga mientras al mismo tiempo aprietas y bloqueas completamente el hemostático para evitar la pérdida del fijador. Sujeta el hemostático de modo que quede paralelo a la superficie de trabajo con la vejiga apoyada encima. Levanta suavemente y corta con cuidado bajo el hemostado para quitar la vejiga con el hemostato aún adherido.

Coloca la vejiga y el hemostato conectado en un tubo Falcon que contiene un fijador calentado. Asegúrate de que la vejiga esté completamente sumergida en el líquido y no presionada contra las paredes del tubo.

Para obtener imágenes de la vejiga mediante microscopía electrónica de barrido, se corta sagittalmente en dos con una cuchilla de afeitar o bisturí limpio y de doble cara, y se realiza un segundo corte tangencial al hemostáto para liberar la vejiga. Esto da lugar a dos copas de media vejiga. Si quedan almohadillas grasas en el exterior de la vejiga, retíralas suavemente.

Enjuaga las mitades de la vejiga tres veces con un tampón de cacodilato de sodio. Teñe el tejido con tetróxido de osmio al 1% en un tampón de cacodilato de 0,15 molares durante 1 hora a temperatura ambiente. Realiza este paso con el recipiente de tinción envuelto en papel de aluminio para mantener un ambiente oscuro. Después de teñir, enjuaga las mitades de la vejiga tres veces en agua ultrapura.

Si se observa aceite osmicado en la superficie del agua, aspirarlo o retirarlo para evitar la contaminación durante los pasos de secado. Tras deshidratar el tejido, se parten por la mitad las mitades de la vejiga con una cuchilla limpia y de doble cara para obtener un total de cuatro piezas.