Name: Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a realizar cateterización transuretral en ratones machos y hembras para estudiar infecciones del tracto urinario. Este método permite comparar respuestas inmunitarias entre sexos y explorar patologías vesicales específicas.

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Agradecemos al Dr. Matthieu Rousseau lectura crítica del manuscrito y el laboratorio de Inmunobiología dendríticas para sus ideas útiles durante el desarrollo de este protocolo y proyecto. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Unión Europea séptimo programa Marie Curie de acción del marco (PCIG11-GA-2012-3221170 y la empresa LabEx inmuno-Oncología (MAI).

Se realizaron experimentos de ratón según aprobación de número de protocolo 2012-0024 el Comité d ' éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (Comité ético de experimentación animal), en aplicación de la Directiva 2010/63 europeo UE.
1. preparación de los catéteres
<ol><li>Preparar una cánula pediátrica de acceso intravenoso para cada grupo de ratones infectados. Utilizando el mecanismo de resorte incorporado, desprenderse de cada cánula de la aguja, según las instrucciones del fabricante. Deseche las agujas, conservando sólo el plástico cánula intravenosa.</li>
	<li>Esterilizar los catéteres en una campana de flujo laminar para ciclo de un ultravioleta (U.V.), típicamente 25-30 min. Nota: Los catéteres pueden utilizarse para más de un ratón, sin embargo un nuevo catéter debe utilizarse entre grupos experimentales, sexos o cepas bacterianas.</li>
</ol>2. preparación de uropatógenos Escherichia coli infección
<ol><li>Al menos dos días antes de la infección, mediante un asa de inoculación estéril, racha UPEC de un stock congelado bacteriano sobre una placa de agar caldo de Luria (LB), que contengan antibióticos si procede. Incubar a 37 ° C durante la noche. Las placas pueden almacenarse a 4 ° C hasta una semana.</li>
	<li>En un erlenmeyer estéril de 100 ml, inocular 10 ml LB, que contengan antibióticos si es necesario, con una sola Colonia de la placa LB e incubar a 37 ° C durante la noche (aproximadamente 16-18 hr) de pie. Nota: Pie culturas permiten la expresión de tipo 1 pili, que son necesarios para la infección23. Culturas crecidas agitación tendrá menos eficiente expresión de pili y por lo tanto, incoherentes tasas de infección.</li>
	<li>Medir la densidad óptica (OD)600 de la cultura durante la noche y calcular el número de bacterias por ml con una curva de crecimiento determinado. Como ejemplo, para la cepa de la UPEC UTI89, OD600 = 0.35 es equivalente a 2 x 108 UFC / ml, por lo tanto, una cultura de la noche con un OD600 = 2.4 sería equivalente a 13.7 x 108 CFU por ml. determinar empíricamente la relación entre la OD600 y con cada nueva cepa empleada para la infección de bacterias viables.</li>
	<li>
Determinar la cantidad de bacterias necesarias teniendo en cuenta el número de animales infectados y que cada ratón debe recibir aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 50 μl de PBS. Incluir en el cálculo el ~ 130 μl volumen muerto de la jeringa y catéter nub y 100 μl debían determinar el inóculo.
	<ol>
<li>Hacer girar la suspensión bacteriana en una microcentrífuga de sobremesa a 17.000 x g durante 1 min y resuspender el precipitado bacteriano que resulta en 2 x 108 UFC / ml en PBS. En serie diluir una alícuota de esta suspensión y la placa en agar LB, con antibióticos si es necesario determinar el exacto inóculo para cada infección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dibujar el inóculo bacteriano en una jeringa de 1 ml y coloque el catéter en el extremo de la jeringa. Golpee la jeringa para quitar cualquier aire y presione el émbolo para llenar el espacio de aire muerto en el catéter antes de iniciar la instilación.</li>
</ol>3. preparación de los ratones
<ol><li>Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina. Se puede proporcionar calor suplementario.</li>
	<li>Asegúrese de que cada ratón es totalmente sedado apretando el bandolero con presión media. Ratones son totalmente sedados cuando no reaccionan y requieren 3-5 min para llegar a este estado.</li>
	<li>Coloque ratones supina y aplique presión mediana en la parte inferior del abdomen para vaciar la vejiga de la orina. Vejigas completos sensación como un guisante debajo de la piel entre la cresta ilíaca. Nota: Isoflurano inhalado se ha utilizado para cateterizar ratones hembra15,22, sin embargo, no ha sido probado si ratones machos son suficientemente anestesiados por isoflurano inhalado para este procedimiento.</li>
</ol>4. transuretral instilación de ratones femeninos
<ol><li>Usando la mano no dominante, coloque el pulgar en la cola y un dedo de la misma mano en el abdomen del ratón y aplique presión suave en opuestas direcciones para mantener el ratón firmemente en su lugar.</li>
	<li>
Coloque la punta del catéter perpendicular al ratón en el orificio uretral. Con una ligera presión, deslice el catéter en la uretra, hasta el centro del orificio uretral, reduciendo simultáneamente la jeringa de modo que sea paralelo a la superficie de trabajo. El catéter no requiere lubricación. No empujar ni forzar el catéter en la uretra. El catéter debe deslizarse suavemente y fácilmente en la uretra, con poca o ninguna resistencia.
	<ol>
<li>Antes de aplicar el inóculo (paso 4.3), una vez que el catéter está en su lugar, muy suavemente Hale la piel del abdomen hacia la cabeza del ratón con el dedo desde el no-dominante de la mano ya está en el abdomen del ratón (paso 4.1). Si el catéter está en la uretra, el tejido que compone el orificio de la uretra no se mueve, mientras que si el catéter se coloca incorrectamente en la vagina, el tejido se moverá hacia arriba y fuera del catéter. Esta prueba rápida debe realizarse en cada ratón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando el eje del catéter se encuentra con el orificio uretral, lentamente dispensar 50 μl del inóculo bacteriano. Una tasa de instilación lenta minimiza el reflujo vesicoureteral en el riñón. Retire lentamente el catéter para evitar fugas, más de una cuenta de 5. Lugar de ratones en sus jaulas en una posición supina.</li>
</ol>5. transuretral instilación de ratones machos
<ol><li>Coloque dos pinzas pulgar cranially y caudalmente a los genitales externos del ratón. Retraer el prepucio para exponer completamente el glande del pene. Una vez que el pene se coloca externamente, suelte la pinza del pulgar.</li>
	<li>Vuelva a colocar las pinzas para estabilizar el pene que sobresale perpendicularmente a los animales, el órgano suavemente pero tenso. Visualizar el meato uretral e introducir cuidadosamente el catéter en la pequeña abertura en la punta del órgano. Guiar suavemente el catéter en el pene, hacia el cuerpo del ratón, manteniendo tensión suave con el fórceps. El catéter no requiere lubricación. No forzar el catéter en el pene; el catéter debe deslizarse suavemente en la uretra, lo que indica la correcta colocación.</li>
	<li>Una vez que el eje del catéter se encuentra con la punta del pene, muy lentamente dispensar 50 μl del inóculo, mientras mantiene la posición del pene. La calidad de la instilación puede señalarse en este momento según una puntuación de calidad de instilación predeterminado, como se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Retraiga el catéter lentamente, sobre un conteo de 5, para evitar la fuga del inóculo. Lugar de ratones en sus jaulas en una posición supina. Animales deben empezar a recuperar 30-45 min después de la administración de la anestesia.</li>
</ol>6. determinación de UFC en órganos infectados
<ol><li>En momentos predeterminados, ratones de sacrificio utilizando aprobaron procedimientos normalizados de trabajo (por ejemplo, la dislocación cervical o sobredosis de dióxido de carbono). Humedezca el abdomen con etanol al 70% para minimizar la contaminación por piel.</li>
	<li>Hacer una incisión en el tercio inferior del abdomen del ratón de menos de 2 cm con unas tijeras y extraiga de forma aséptica la vejiga y cualquier otro órganos deseados, incluyendo pero no limitado a, los riñones, testículos, vesículas seminales o glándulas prepuciales, en 5 ml tubos con tapón de polipropileno snap que contiene 1 ml PBS estéril. Mantener las muestras en hielo.</li>
	<li>Homogeneizar los órganos con un homogeneizador handheld hasta que no quede casi tejido sólido, aproximadamente de 15-60 segundos dependiendo del órgano. La grasa no homogeneizar bien y es fácilmente reconocible como tejido beige-blanco brillante. Deseche la grasa antes o después de la homogeneización. Lave el homogeneizador en etanol seguido de PBS entre cada experimental o grupo de órganos. Nota: Normalmente, utilizar homogeneizadores portátiles u Homogeneizadores de molino de grano. Mientras que todos estos sistemas han dado resultados similares, según lo determinado por la comparación directa de bacteria UFC en 24 horas post infección, las condiciones óptimas para homogeneizar el tejido del anfitrión mientras que preserva la viabilidad bacteriana deben determinarse empíricamente antes de realización de este protocolo rutinario.</li>
	<li>Realizar diluciones seriadas de suspensiones homogeneizadas de órgano. Diluciones en placas de agar LB, que contengan antibióticos cuando sea apropiado, la placa e incubar durante la noche (~ 15 hr) a 37 ° C. Cepas UPEC poseen tiempos de doblaje muy rápidos y como tal, debe tener cuidado para no incubar las placas de agar demasiadas ya que esto dificultará la capacidad de contar las colonias individuales.</li>
</ol>7. flujo cytometric del análisis del tejido de la vejiga
<ol><li>Preparar el tampón de digestión con colagenasa en 34 unidades/mL y DNasa en 100 μg/mL en PBS. Mantener en hielo. Preparar un tubo cónico de 15 ml por animal a analizar y alícuota 1 ml del tampón de digestión por el tubo.</li>
	<li>En horarios predeterminados, ratones de sacrificio utilizando aprobaron procedimientos normalizados de trabajo (por ejemplo, la dislocación cervical o sobredosis de dióxido de carbono). Humedezca el abdomen con etanol al 70% para minimizar la contaminación por piel.</li>
	<li>
Hacer una incisión en el tercio inferior del abdomen del ratón de menos de 2 cm con unas tijeras y quitar la vejiga entera. Picadillo con las tijeras, cortar la vejiga en 2-3 mm2 tamaño de piezas, generalmente de 8 piezas.
	<ol>
<li>Añadir una picada vejiga por tubo con tampón de digestión. Agitar para lavar el tejido de la vejiga picada en el buffer de digestión. Mantenga en hielo hasta que todos están disecados y picada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar picadas vejigas para 60-75 min a 37 ° C, con vigoroso a mano 5 s cada 15 minutos. Cuando el tejido tiene una apariencia vidriosa transparente, papel de tejido mojado, que se asemeja a la digestión es completa. Digestión prolongada elimina proteínas de la superficie de las células necesarias para la identificación y debe evitarse.</li>
	<li>Inactivar las enzimas de la digestión mediante la adición de 2-3 mL de tampón de citometría de flujo helado (PBS conteniendo 2% de suero bovino fetal (FBS) y 0,2 mM EDTA) y mezclar suavemente. Coloque los tubos en hielo.</li>
	<li>Para asegurar una suspensión unicelular y para quitar cualquier tejido conectivo, pasar el contenido del tubo a través de un filtro de 100 μm en un tubo cónico de 15 mL. Presione suavemente cualquier tejido remanente a través del filtro con el extremo de un émbolo de la jeringa. Lavar el filtro con un búfer de citometría de flujo 2 mL adicionales. Mantener las muestras en hielo.</li>
	<li>Las muestras de lavado por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 º C. Resuspender el pellet en 100 μl flujo cytometry con Fc bloque de amortiguamiento, diluido a 5 μg/mL y transferir a un pozo de 96 placa de fondo redondo. Después de 10-15 minutos, agregar 100 μl deseado anticuerpo cóctel para cada muestra. Incubar las muestras durante 30-45 min, en hielo, protegidos de la luz. Nota: El bloque Fc es un reactivo utilizado para prevenir el atascamiento de la porción Fc de los anticuerpos a las células que expresan receptores Fc. Su objetivo es minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo. Determinación de anticuerpos a utilizar dependerá de la hipótesis ensayada en el experimento y debe ser seleccionado con la entrada de la literatura. En la figura 3, para medir la infiltración de células inmunes en general, se empleó un anticuerpo anti-CD45, que es una proteína de la célula inmune al pan.</li>
	<li>Las muestras de lavado por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 º C. Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón de citometría flujo y pasan las muestras a través de un tamiz de célula 40 μm en un tubo de poliestireno de 5 ml antes de la adquisición en un citómetro de flujo.</li>
	<li>Recoger toda la muestra en el citómetro de flujo. Una buena digestión producirá 200.000-400.000 células, con 8.000-10.000 CD45+ las células inmunes de vejigas de ratón ingenuo, mientras que órganos infectados contendrá más de las células16 (figura 3). Nota: Las muestras preparadas para análisis cytometric del flujo no pueden utilizarse para evaluar UFC. No se recomienda separar la vejiga en dos partes ya que no existen pruebas que demuestran la colonización UPEC o infiltración de células inmunes es uniforme en todo el tejido.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La instilación transuretral de ratones machos ofrece muchas nuevas oportunidades de investigación en la influencia del sexo en la enfermedad de la mucosa vesical, pero también presenta varios desafíos. Primero, una limitación es que la instilación puede inicialmente resultar técnicamente difícil, resultando en inflamación excesiva durante la inserción del catéter. Mejora en la técnica puede lograrse mediante la instilación de ratones muertos con una solución coloreada, como colorante azul de Evans. Para confirmar que la ...

Infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones más comunes en los países desarrollados1. Las tasas de infección son similares entre las hembras y los machos entre los recién nacidos y los ancianos2. Mujeres premenopáusicas, sin embargo, tienen una mayor incidencia de infección urinaria adquirida en la comunidad, en comparación con los hombres2,3. Dado que esta enfermedad afecta principalmente a mujeres, investigación fundamental y clínica ha centrado abrumadoramente en IU en las mujeres. Sin embargo, la infección urinaria en los hombres es un reto de salud importantes y escasamente4. De hecho, debido a infección urinaria en los hombres se asocian con mayor morbilidad, estas infecciones se definen habitualmente como complicado4,5.
Como nuestra comprensión del papel central de los sesgos de sexo en fisiología y patología evoluciona, nuevos métodos están obligados a explorar este aspecto anteriormente desatendida de la enfermedad. Diferencias de sexo juegan un papel esencial en la inmunidad y la infección; las hembras tienen mayor incidencia de enfermedad autoinmune, mientras que los machos son más susceptibles a ciertas infecciones, como tuberculosis, malaria y VIH6,7. Cáncer de vejiga, otra patología urológica, es significativamente más frecuente en hombres que en mujeres, y varios estudios han demostrado un papel de los andrógenos en el desarrollo de malignidad8,9,10,11 ,12. En particular, sin embargo, investigación de terapias intravesical para el cáncer de vejiga se realiza exclusivamente en hembras, debido a la imposibilidad de cateterizar repetidamente ratones machos13.
El estudio de la patogenia de la infección urinaria se apoya fuertemente en modelos de roedores de la infección (por ejemplo, ratones y ratas). Modelos murinos de infección urinaria pueden emplear patógenos originalmente aislaron de infecciones humanas, tales como uropatógenos Escherichia coli (UPEC), Klebsiella, enterococo, estafilococoo Proteus14. Por lo general, las bacterias se introducen en la vejiga por cateterización de la uretra. Después de la infección, vejiga y riñones pueden ser removida para evaluar parámetros específicos de infección, colonización bacteriana, daño tisular o anfitrión inmunorespuesta15,16. Universalmente, sin embargo, sólo los animales femeninos son utilizados para investigación UTI. De hecho, muchos estudios han señalado que, por razones anatómicas, cateterización de ratones machos no es posible13,17,18,19. Más recientemente, se ha descrito un abordaje quirúrgico a la instilación de macho, en que se abre el abdomen, la vejiga es desplazada externamente aplicando presión suave a la abertura en el abdomen y se inyectan las bacterias en la vejiga20. Este enfoque permite la infección del hombre, a costa de la intervención quirúrgica. Por lo tanto, una advertencia importante de este enfoque incluye la influencia de la inflamación, sobre el resultado de infección, como el potencial de inducir una respuesta antiinflamatoria cicatrizante a la incisión21. Como nuestros intereses incluyen comprensión sesgo sexual en respuesta a la enfermedad, se desarrolló un método de instilación intravesical bacteriana en ratones machos que más se parezca el abordaje transuretral no quirúrgico larga utilizado en roedores hembra22 .
Nuestro modelo se basa en una metodología establecida y ofrece la posibilidad de comparar directamente el anfitrión inmunorespuesta a UTI en animales hembras y machos. Este método permite la disección de diferencias basadas en el sexo en la infección y potencialmente ofrecer pistas moleculares y celulares a las pronunciadas diferencias en la susceptibilidad y respuesta a la infección entre los sexos. Además, este modelo tiene valor más allá de los estudios UTI, permitiendo el establecimiento de modelos para investigar otras enfermedades de vejiga asociados, tales como cáncer de vejiga, prostatitis, semi-activo bajo o sobre el síndrome de vejiga y cistitis intersticial.

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard Catéteres intravenosos blindados de 24 g, 0,7 mm de diámetro externo, 14 mM de largo</td><td>BD Medical</td><td>381811 o 381411*</td><td>* El número de catálogo depende del país</td></tr><tr><td>Asa de inoculación</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>jeringas</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de pulgar (Adson)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 5 ml, polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor sondas desechables</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tapa abatible de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>deben ser alícuotas y almacenarse a -20 &deg; C para evitar la congelación-descongelación repetida</td></tr><tr><td>100 &micro; M MACS SmartStrainers&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>compatible con tubos de 15 ml, preferido</td></tr><tr><td>100 y micro; Filtros de células M&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>compatible con tubos de 50 ml, si no se dispone de MACS Smart Strainers</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloque</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anti-CD16/CD32</td></tr><tr><td>anticuerpo CD45 anti-ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>muchas opciones diferentes de conjugación fluorescente disponibles</td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml de poliestireno con tapón de filtro</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>jeringa de insulina</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador de mano</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueCitómetro</td></tr><tr>de<td>flujo</td><td>Ruptor BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de citometría de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

infección del tracto urinario en un modelo animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infecciones del tracto urinario (ITU) son extremadamente comunes en todo el mundo, incurriendo en gastos asociados de salud y morbilidad significativa. Pequeños modelos animales, que reflejan con precisión la progresión y el establecimiento de la enfermedad, permiten la disección de las interacciones huésped-patógeno y generación de inmunidad a la infección. En ratones, instilación intravesical de uropatógenos Escherichia coli, el agente causal en más del 85% de la comunidad adquirida UTI, recoge muchas de las etapas de la infección observada en los seres humanos. Hasta hace poco, sin embargo, IU podría solamente ser modelada en hembras. Esta limitación ha obstaculizado el estudio de las diferencias relacionadas con el sexo en UTI, así como otras patologías de vejiga, como el cáncer. Aquí, describimos un método para infundir ratones macho que permite la comparación directa entre los animales hembras y machos y proporcionan un protocolo detallado para evaluar el tejido de la vejiga mediante citometría de flujo como un medio para comprender mejor las respuestas del anfitrión a la infección. Juntos, estos enfoques ayudará a la identificación de factores de huésped que contribuyen al sexo sesgos observados en UTI y otras enfermedades asociadas a la vejiga.

En el desarrollo de este protocolo, cohortes de mujeres y hombres ratones C57Bl/6 años 6 a 8 semanas carga inculcada y bacterianas evaluadas en vejigas en momentos que van desde 1 hora a 30 días. Los resultados de estos estudios se detallan en otro lugar (Zychlinsky Scharff et al., pendiente). Aquí, presentamos datos representativos de las infecciones de 24 horas. En particular, la carga bacteriana fue equivalente entre ratones machos y hembras en 24 horas post infección (<strong...

El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

El objetivo general de este enfoque experimental es investigar la respuesta inmunitaria a la infección del tracto urinario y evitar la comparación directa entre animales machos y hembras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la inmunología de la mucosa relacionadas con la forma en que los hombres y las mujeres responden a la infección del tracto urinario. La principal ventaja es que la infección se establece a través de la raíz natural.Primero tuvimos la idea de este método después de notar la frecuencia con la que se afirma que la instalación de la vejiga de los ratones machos es imposible. Aunque este método proporcionará información sobre la infección del tracto urinario, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades, como el cáncer de vejiga. Para comenzar, prepare una cánula pediátrica de acceso intravenoso para cada grupo de ratones que se infectarán.Usando el mecanismo de resorte incorporado, retire cada cánula de su aguja según las instrucciones del fabricante. Deseche las agujas, conservando solo la cánula intravenosa de plástico. Esterilice los catéteres en una campana de flujo laminar durante un ciclo UV de aproximadamente 25 a 30 minutos.Después de pasar por el cultivo nocturno de E. coli uropatógena, o UPEC, de acuerdo con el protocolo de texto, haga girar la suspensión bacteriana en una microcentrífuga de mesa a 17.000 veces g durante un minuto y vuelva a suspender la pelletza bacteriana resultante a dos veces 10 a la octava UFC por mililitro en PBS. Diluir en serie una alícuota de suspensión, y cubrir agar LB con antibióticos si corresponde, para determinar el inóculo exacto para cada infección. Extraiga el inóculo bacteriano en una jeringa de un mililitro y conecte el catéter al extremo de la jeringa.Golpee la jeringa para eliminar el aire y presione el émbolo para llenar el espacio de aire muerto en el catéter antes de comenzar la instilación. Después de anestesiar a una rata hembra de acuerdo con un protocolo aprobado, coloque al animal en decúbito supino y aplique presión media en la parte inferior del abdomen para vaciar la vejiga de orina. Las vejigas llenas se sienten como un guisante debajo de la piel, entre las crestas ilíacas.Cuando la vejiga esté vacía, usando la mano no dominante, coloque el pulgar en la cola y un dedo de la misma mano en el abdomen del ratón, y aplique una presión suave en direcciones opuestas para mantener el mouse firmemente en su lugar. A continuación, coloque la punta del catéter perpendicular al ratón en el orificio uretral, luego, con una presión suave, deslice el catéter en la uretra hasta que el cubo se encuentre con el orificio uretral, mientras baja simultáneamente la jeringa para que quede paralela a la superficie de trabajo. Una vez que el catéter esté en su lugar, use un dedo de la mano no dominante que descansa sobre el abdomen del ratón para tirar muy suavemente de la piel abdominal hacia la cabeza del ratón.Tenga en cuenta que el orificio uretral no se moverá. Sin embargo, si los catéteres están en la vagina, el tejido se moverá hacia arriba y se alejará del catéter. Con el cubo del catéter contra el orificio uretral, dispense lentamente 15 microlitros del inóculo bacteriano.Una tasa de instalación lenta minimiza el reflujo vesicoureteral en el riñón. Retire lentamente el catéter para evitar fugas. A continuación, coloque al animal en su jaula en posición supina.Para inocular ratones machos, coloque dos pinzas para el pulgar craneal y caudalmente en los genitales externos de los ratones. Retraiga el prepucio para exponer completamente el pene de la glándula. Luego, una vez que el pene esté colocado externamente, suelte las pinzas del pulgar.Vuelva a colocar las pinzas para estabilizar el pene que sobresale perpendicular al animal, sosteniendo el órgano suave pero tensamente. Luego, a través de la pequeña abertura en la punta del meato uretral, introduzca con cuidado el catéter y guíelo suavemente hacia el pene con pinzas para mantener suavemente la tensión. Una vez que el centro de los catéteres se encuentra con la punta del pene, dispense muy lentamente 50 microlitros del inóculo, mientras mantiene la posición del pene.Tenga en cuenta la calidad de la instilación de acuerdo con una puntuación de calidad de instilación predeterminada, como la que se muestra aquí. Retraiga el catéter lentamente durante cinco segundos para evitar fugas del inóculo. Coloque al ratón en su jaula en posición supina.El animal debe comenzar a recuperarse de 30 a 45 minutos después de la administración del anestésico. Después de sacrificar ratones de acuerdo con un protocolo aprobado, use 70%Epinal para humedecer bien el abdomen y minimizar la contaminación por el pelaje. Con unas tijeras, haga una incisión de dos centímetros en el tercio inferior del abdomen del ratón y extraiga asépticamente la vejiga y cualquier otro órgano deseado.Transfiera los órganos a tubos de polipropileno de cinco mililitros, que contengan un mililitro de PBS estéril y mantenga todas las muestras en hielo. Con un homogeneizador manual, homogeneice los órganos hasta que casi no quede tejido sólido. Deseche cualquier tejido graso brillante de color blanco beige que no se homogeneice bien.A continuación, utilice Epinal, seguido de PBS para lavar el homogeneizador entre cada grupo experimental o de órganos. Después de preparar diluciones seriadas de suspensión de órganos homogeneizados, se deben realizar diluciones en placas de agar LB, con antibióticos cuando corresponda, e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Para llevar a cabo la citometría de flujo en el tejido vesical, después de aislar la vejiga como se demostró anteriormente en este video, use tijeras para picar bien el tejido.Agregue una vejiga picada por tubo que contenga tampón de digestión. Luego agite el tubo para lavar el tejido picado en el tampón de digestión y manténgalo en hielo hasta que todas las vejigas estén diseccionadas y picadas. Incubar las vejigas picadas a 37 grados centígrados, durante 60 a 75 minutos con agitación vigorosa con la mano durante cinco segundos, cada 15 minutos.Cuando el pañuelo tiene una apariencia transparente vítrea que se asemeja al papel de seda mojado, la digestión es completa. Inactive las enzimas de digestión agregando de dos a tres mililitros de tampón de citometría de flujo helado y mezcle suavemente. A continuación, coloque los tubos sobre hielo.Para asegurar una suspensión unicelular, y para eliminar cualquier tejido conectivo, pase el contenido del tubo a través de un filtro de 100 micrómetros colocado en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, con el extremo de un émbolo de jeringa, presione suavemente cualquier tejido restante a través del filtro. Lave el filtro con dos mililitros adicionales de tampón de citometría de flujo y mantenga las muestras en hielo.Lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g y cuatro grados centígrados, durante siete minutos. Vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de citometría de flujo que contenga el bloque Fc, diluido a cinco microgramos por mililitro, y transfiéralo a una placa inferior redonda de 96 pocillos. Después de 10 a 15 minutos, agregue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos deseado a cada muestra.A continuación, incubar las muestras en hielo protegido de la luz durante 30 a 45 minutos. Lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g y cuatro grados centígrados durante siete minutos. Finalmente, vuelva a suspender los gránulos de celda en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo y pase las muestras a través de un filtro de celdas de 40 micrómetros en un tubo de poliestireno de cinco mililitros, justo antes de la adquisición en un citómetro de flujo.Esta figura muestra datos representativos de ratones infectados durante 24 horas. La carga bacteriana fue equivalente entre ratones machos y hembras a las 24 horas después de la infección. Para determinar si la pérdida de inóculo en el momento de la infección afectaba al establecimiento de la infección, cada instilación se puntuó en una escala de uno a cinco, siendo uno el más óptimo.La colonización bacteriana se determinó a las 24 horas postinfección. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las UFC obtenidas de animales con diferentes puntuaciones de instilación evaluadas por una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, comparando el rango medio de cada columna con el rango medio de todas las demás columnas, y corrigiendo las comparaciones múltiples utilizando una prueba de Dunn. Se puede concluir que las instilaciones subóptimas, que resultan en una fuga sustancial de inóculo bacteriano durante la infección, no impactan significativamente en la colonización bacteriana a las 24 horas.Es importante destacar que la frecuencia de la instilación subóptima disminuirá con la práctica. Por último, aunque el número de células inmunitarias CD45 positivas, presentes en los animales naïve, no fue diferente entre los ratones hembra y los machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en la infiltración en la vejiga de los ratones hembra infectados. Al intentar el cateterismo, es importante usar movimientos lentos y suaves.Con su desarrollo, esta técnica nos ha ayudado a explorar las diferencias basadas en el sexo en la inmunidad en la vejiga de animales machos y hembras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Fuente: Luyts, N., et al. Seguimiento longitudinal de infecciones urinarias y su tratamiento en ratones mediante imagen bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo muestra la inducción y seguimiento de la infección urinaria en un modelo murino utilizando E. coli bioluminiscente inyectada en la vejiga, donde ocurren adhesiones, invasión y replicación intracelular bacteriana. La luz emitida por el operón bioluminiscente sirve como marcador en tiempo real de la carga bacteriana durante la...

Visualización de la infección del tracto urinario en un modelo murino usando bioluminiscencia

Fuente: Conover, M. S., et al., J. Establecimiento y caracterización de ITU y CAUTI en un modelo murinho. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo muestra el procedimiento para ensamblar e implantar un catéter transuretral en una ratona, seguido de la inoculación bacteriana para establecer la infección urinaria asociada al catéter e investigar las interacciones hospedador-patógeno mediadas por biofilm.

Infección urinaria asociada a catéter en un modelo murino

En este video, describimos la técnica para la administración intravesical de bacterias uropatógenas para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones. Este modelo se puede utilizar para comprender la propagación de la infección bacteriana uropatógena dentro del sistema urinario y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a las infecciones urinarias.

Modelo de Generación de Infección del Tracto Urinario: Una Técnica para Administrar Bacterias Uropatógenas en Ratón para Desarrollar un Modelo de Infección del Tracto Urinario

Este video demuestra el establecimiento de una infección uropatógena por Escherichia coli en una vejiga de ratón hembra a través de la instilación de catéter transuretral. Las bacterias inyectadas establecen con éxito una infección del tracto urinario dentro de la vejiga, proporcionando una valiosa plataforma para estudiar las enfermedades asociadas a la atención médica relacionadas con el tracto urinario.

Cateterismo transuretral e inoculación bacteriana para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones machos

Establecimiento de un modelo de infección del tracto urinario en ratones hembra

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad antitumoral de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori, o HP-NAP, en un modelo de cáncer de vejiga de ratón. HP-NAP interactúa con los neutrófilos de las células tumorales para producir citocinas proinflamatorias, induciendo la diferenciación de las células T vírgenes en fenotipos de células T auxiliares de tipo 1 (Th1) y citotóxicas de tipo 1 (Tc1). Las células Th1 y Tc1 secretan interferón gamma, inhibiendo la...

Evaluación de la eficacia antitumoral de una proteína inmunomoduladora bacteriana en un modelo murino

La capacidad de modelar infecciones del tracto urinario (ITU) es crucial para poder comprender la patogénesis bacteriana y generar el desarrollo de nuevas terapias. El objetivo de este trabajo es demostrar modelos murinos de ITU experimentales e ITU asociadas a catéteres que recapitulen y predigan los hallazgos observados en humanos.

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

La instilación transuretral es un procedimiento difícil y no ha sido bien descrita en la literatura. El objetivo de este manuscrito es describir una técnica para la inserción transuretral de un catéter para la administración intravesical de líquidos con sustancias activas en la vejiga o la próstata en ratones macho adultos.

Procedimiento transuretral instilación en ratón macho adulto

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.

Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia

Aprende a realizar cateterización transuretral en ratones machos y hembras para estudiar infecciones del tracto urinario. Este método permite comparar respuestas inmunitarias entre sexos y explorar patologías vesicales específicas.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

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