Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

El objetivo general de este enfoque experimental es investigar la respuesta inmunitaria a la infección del tracto urinario y evitar la comparación directa entre animales machos y hembras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la inmunología de la mucosa relacionadas con la forma en que los hombres y las mujeres responden a la infección del tracto urinario. La principal ventaja es que la infección se establece a través de la raíz natural.

Primero tuvimos la idea de este método después de notar la frecuencia con la que se afirma que la instalación de la vejiga de los ratones machos es imposible. Aunque este método proporcionará información sobre la infección del tracto urinario, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades, como el cáncer de vejiga. Para comenzar, prepare una cánula pediátrica de acceso intravenoso para cada grupo de ratones que se infectarán.

Usando el mecanismo de resorte incorporado, retire cada cánula de su aguja según las instrucciones del fabricante. Deseche las agujas, conservando solo la cánula intravenosa de plástico. Esterilice los catéteres en una campana de flujo laminar durante un ciclo UV de aproximadamente 25 a 30 minutos.

Después de pasar por el cultivo nocturno de E. coli uropatógena, o UPEC, de acuerdo con el protocolo de texto, haga girar la suspensión bacteriana en una microcentrífuga de mesa a 17.000 veces g durante un minuto y vuelva a suspender la pelletza bacteriana resultante a dos veces 10 a la octava UFC por mililitro en PBS. Diluir en serie una alícuota de suspensión, y cubrir agar LB con antibióticos si corresponde, para determinar el inóculo exacto para cada infección. Extraiga el inóculo bacteriano en una jeringa de un mililitro y conecte el catéter al extremo de la jeringa.

Golpee la jeringa para eliminar el aire y presione el émbolo para llenar el espacio de aire muerto en el catéter antes de comenzar la instilación. Después de anestesiar a una rata hembra de acuerdo con un protocolo aprobado, coloque al animal en decúbito supino y aplique presión media en la parte inferior del abdomen para vaciar la vejiga de orina. Las vejigas llenas se sienten como un guisante debajo de la piel, entre las crestas ilíacas.

Cuando la vejiga esté vacía, usando la mano no dominante, coloque el pulgar en la cola y un dedo de la misma mano en el abdomen del ratón, y aplique una presión suave en direcciones opuestas para mantener el mouse firmemente en su lugar. A continuación, coloque la punta del catéter perpendicular al ratón en el orificio uretral, luego, con una presión suave, deslice el catéter en la uretra hasta que el cubo se encuentre con el orificio uretral, mientras baja simultáneamente la jeringa para que quede paralela a la superficie de trabajo. Una vez que el catéter esté en su lugar, use un dedo de la mano no dominante que descansa sobre el abdomen del ratón para tirar muy suavemente de la piel abdominal hacia la cabeza del ratón.

Tenga en cuenta que el orificio uretral no se moverá. Sin embargo, si los catéteres están en la vagina, el tejido se moverá hacia arriba y se alejará del catéter. Con el cubo del catéter contra el orificio uretral, dispense lentamente 15 microlitros del inóculo bacteriano.

Una tasa de instalación lenta minimiza el reflujo vesicoureteral en el riñón. Retire lentamente el catéter para evitar fugas. A continuación, coloque al animal en su jaula en posición supina.

Para inocular ratones machos, coloque dos pinzas para el pulgar craneal y caudalmente en los genitales externos de los ratones. Retraiga el prepucio para exponer completamente el pene de la glándula. Luego, una vez que el pene esté colocado externamente, suelte las pinzas del pulgar.

Vuelva a colocar las pinzas para estabilizar el pene que sobresale perpendicular al animal, sosteniendo el órgano suave pero tensamente. Luego, a través de la pequeña abertura en la punta del meato uretral, introduzca con cuidado el catéter y guíelo suavemente hacia el pene con pinzas para mantener suavemente la tensión. Una vez que el centro de los catéteres se encuentra con la punta del pene, dispense muy lentamente 50 microlitros del inóculo, mientras mantiene la posición del pene.

Tenga en cuenta la calidad de la instilación de acuerdo con una puntuación de calidad de instilación predeterminada, como la que se muestra aquí. Retraiga el catéter lentamente durante cinco segundos para evitar fugas del inóculo. Coloque al ratón en su jaula en posición supina.

El animal debe comenzar a recuperarse de 30 a 45 minutos después de la administración del anestésico. Después de sacrificar ratones de acuerdo con un protocolo aprobado, use 70%Epinal para humedecer bien el abdomen y minimizar la contaminación por el pelaje. Con unas tijeras, haga una incisión de dos centímetros en el tercio inferior del abdomen del ratón y extraiga asépticamente la vejiga y cualquier otro órgano deseado.

Transfiera los órganos a tubos de polipropileno de cinco mililitros, que contengan un mililitro de PBS estéril y mantenga todas las muestras en hielo. Con un homogeneizador manual, homogeneice los órganos hasta que casi no quede tejido sólido. Deseche cualquier tejido graso brillante de color blanco beige que no se homogeneice bien.

A continuación, utilice Epinal, seguido de PBS para lavar el homogeneizador entre cada grupo experimental o de órganos. Después de preparar diluciones seriadas de suspensión de órganos homogeneizados, se deben realizar diluciones en placas de agar LB, con antibióticos cuando corresponda, e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Para llevar a cabo la citometría de flujo en el tejido vesical, después de aislar la vejiga como se demostró anteriormente en este video, use tijeras para picar bien el tejido.

Agregue una vejiga picada por tubo que contenga tampón de digestión. Luego agite el tubo para lavar el tejido picado en el tampón de digestión y manténgalo en hielo hasta que todas las vejigas estén diseccionadas y picadas. Incubar las vejigas picadas a 37 grados centígrados, durante 60 a 75 minutos con agitación vigorosa con la mano durante cinco segundos, cada 15 minutos.

Cuando el pañuelo tiene una apariencia transparente vítrea que se asemeja al papel de seda mojado, la digestión es completa. Inactive las enzimas de digestión agregando de dos a tres mililitros de tampón de citometría de flujo helado y mezcle suavemente. A continuación, coloque los tubos sobre hielo.

Para asegurar una suspensión unicelular, y para eliminar cualquier tejido conectivo, pase el contenido del tubo a través de un filtro de 100 micrómetros colocado en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, con el extremo de un émbolo de jeringa, presione suavemente cualquier tejido restante a través del filtro. Lave el filtro con dos mililitros adicionales de tampón de citometría de flujo y mantenga las muestras en hielo.

Lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g y cuatro grados centígrados, durante siete minutos. Vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de citometría de flujo que contenga el bloque Fc, diluido a cinco microgramos por mililitro, y transfiéralo a una placa inferior redonda de 96 pocillos. Después de 10 a 15 minutos, agregue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos deseado a cada muestra.

A continuación, incubar las muestras en hielo protegido de la luz durante 30 a 45 minutos. Lavar las muestras por centrifugación a 200 veces g y cuatro grados centígrados durante siete minutos. Finalmente, vuelva a suspender los gránulos de celda en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo y pase las muestras a través de un filtro de celdas de 40 micrómetros en un tubo de poliestireno de cinco mililitros, justo antes de la adquisición en un citómetro de flujo.

Esta figura muestra datos representativos de ratones infectados durante 24 horas. La carga bacteriana fue equivalente entre ratones machos y hembras a las 24 horas después de la infección. Para determinar si la pérdida de inóculo en el momento de la infección afectaba al establecimiento de la infección, cada instilación se puntuó en una escala de uno a cinco, siendo uno el más óptimo.

La colonización bacteriana se determinó a las 24 horas postinfección. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las UFC obtenidas de animales con diferentes puntuaciones de instilación evaluadas por una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, comparando el rango medio de cada columna con el rango medio de todas las demás columnas, y corrigiendo las comparaciones múltiples utilizando una prueba de Dunn. Se puede concluir que las instilaciones subóptimas, que resultan en una fuga sustancial de inóculo bacteriano durante la infección, no impactan significativamente en la colonización bacteriana a las 24 horas.

Es importante destacar que la frecuencia de la instilación subóptima disminuirá con la práctica. Por último, aunque el número de células inmunitarias CD45 positivas, presentes en los animales naïve, no fue diferente entre los ratones hembra y los machos, hubo un aumento estadísticamente significativo en la infiltración en la vejiga de los ratones hembra infectados. Al intentar el cateterismo, es importante usar movimientos lentos y suaves.

Con su desarrollo, esta técnica nos ha ayudado a explorar las diferencias basadas en el sexo en la inmunidad en la vejiga de animales machos y hembras.