Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli

El objetivo general de este procedimiento es crear una biblioteca de mutantes aleatorios para una secuencia de ADN objetivo dada, e identificar y caracterizar rápidamente los mutantes mediante selección funcional semicuantitativa. Esto se logra transformando primero un plásmido con una coli, un origen de replicación que contiene la secuencia objetivo, en la cepa mutadora. Después de colocar e incubar las células durante la noche, se cosechan y se aísla el plásmido objetivo para obtener la biblioteca mutante, la biblioteca mutante se transforma en una cepa de lectura para caracterizar las mutaciones en la segunda parte del protocolo, se construye una placa de crecimiento de gradiente y los cultivos bacterianos de la cepa de lectura se cargan en una placa de Petri separada que contiene aire suave.

El paso final del procedimiento es estampar la transferencia de estos cultivos bacterianos al gradiente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en el perfil fenotípico de una secuencia diana dada a través de diferencias en el crecimiento en un gradiente de fármaco. Este video presenta un método para la evolución dirigida de proteínas en E. coli.

Este proceso imita la evolución natural en la generación de bibliotecas aleatorias de nutrientes, seguida de una selección que restringe esa diversidad. Así, mejora nuestra capacidad de generar nuevas actividades bioquímicas con fines industriales o biomédicos. Este procedimiento tiene dos componentes, la generación de una biblioteca de mutantes aleatorios y la selección funcional para obtener mutaciones de ganancia de función, demostrando este procedimiento será Jennifer Allen, una técnica de mi laboratorio.

Antes del inicio de este protocolo se pensaba que las células electro competentes JS 200 expresaban una variante de baja fidelidad de la ADN polimerasa uno o un polo de baja fidelidad, una que se había preparado previamente como se describe en el protocolo escrito, estas células contienen un alelo sensible a la temperatura del polo uno, de modo que la actividad del polo uno de baja fidelidad predomina a 37 grados centígrados, construir. Un plásmido diana que contiene una coli, un origen de replicación con la secuencia diana clonada adyacente al origen de la replicación, el polo uno de baja fidelidad inicia la replicación coli, un plásmido de replicación. Introduciendo así mutaciones para iniciar la mutagénesis.

Combine 40 microlitros de celdas electrocompetentes y entre 30 y 250 nanogramos de ADN de plasma objetivo en un espacio de dos milímetros. Electroporación vet pulse, la mezcla en el electro a 1800 voltios. Compruebe la constante de tiempo o TC para garantizar las condiciones de uniformidad de cada muestra.

Idealmente, TC equivale a cinco o seis milisegundos. Deje que la mezcla de ADN celular se recupere en un mililitro de caldo LB durante 40 minutos a 37 a 37 grados Celsius agitando a 250 RPM. Obtenga una placa de Petri agro de 100 milímetros LV precalentada a 37 grados Celsius que contenga los antibióticos apropiados para seleccionar para ambos plásmidos las células recuperadas en una dilución adecuada para obtener una concentración cercana al césped, que se define como un número distinto pero incontable de colonias como se muestra en este ejemplo.

Después de la incubación durante la noche, coseche las colonias bacterianas de las placas de Petri con caldo LB. Aísle el plásmido, el ADN de las células cosechadas, el plásmido resultante. El ADN constituye la biblioteca de mutantes aleatorios.

Realice una digestión de restricción cortando la biblioteca de plásmidos con una enzima de restricción que linealiza tanto el plásmido objetivo como el polo. Un plásmido ejecuta un gel aro analítico en el ADN del plásmido aislado para confirmar la calidad y la cantidad. Una vez verificados los plásmidos, digiere un microgramo de la biblioteca con una enzima de restricción que linealiza el plásmido del polo uno, pero no corta el plásmido objetivo.

Una vez completado el resumen de restricción, limpie la biblioteca con un kit de purificación de ADN. Finalmente, transforme la biblioteca limpia en una cepa de lectura para caracterizar las mutaciones. Para comenzar la preparación del degradado, marque 10 carriles espaciados uniformemente a lo largo de un borde de la parte inferior de la placa de Petri cuadrada.

Coloque el plato en una inclinación tal que el borde inferior marcado se eleve siete milímetros. Vierta 25 mililitros de agar lb tibio bien mezclado con una concentración adecuada del agente selector en el plato inclinado. Esta es la capa inferior del degradado.

Asegúrese de que el agar LB cubra la placa de Petri de tal manera que el extremo marcado elevado de la placa contenga aproximadamente un milímetro de agar LB y la parte rebajada contenga aproximadamente ocho milímetros. Cubra la placa con la tapa KU para ventilar y deje que el agri se asiente durante 10 a 15 minutos. Después de que la capa inferior de agar LB se haya endurecido, mueva el plato a una superficie plana.

A continuación, vierta 25 mililitros de agar lb tibio sin el agente selector para superponer la primera superficie agrícola, asegurándose de cubrir toda la capa inferior. Cubra la placa con la tapa KU para ventilar y luego deje que el agri se asiente durante 10 a 15 minutos para realizar la transferencia de bacterias del sello. En primer lugar, se obtienen cultivos bacterianos de la cepa de lectura y se diluyen para obtener densidades celulares idénticas con una densidad óptica de 600 nanómetros inferior a 1,0.

A continuación, transfiera dos mililitros de agar blando líquido equilibrado a 42 grados centígrados al fondo de una placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipetee 40 microlitros del cultivo bacteriano en el más blando y luego mezcle meciendo la placa. Cubra el borde largo del portaobjetos de vidrio del microscopio con la mezcla más suave. A continuación, alinee el borde recubierto de la diapositiva con la marca inferior en el plato de degradado.

Toque el portaobjetos con la superficie del agar. Un tacto suave es suficiente para transferir una cinta del agar blando a la superficie degradada. A continuación, el portaobjetos se deja a un lado para su limpieza y reutilización.

Repite este proceso. El resto de las muestras, los controles experimentales deben incluirse en cada plato de gradiente. Si se ejecutan varios gradientes, incube el plato de gradiente con la parte superior hacia abajo durante la noche a 37 grados Celsius y las temperaturas de incubación pueden diferir para diferentes cepas bacterianas de lectura, pero durante la noche a 37 grados Celsius suele ser suficiente para el crecimiento visible.

Finalmente, obtenga imágenes y analice el crecimiento celular como se describe en el protocolo escrito. Mostrado. Aquí hay imágenes de una cepa de lectura transformada con P-G-F-U-V o una biblioteca mutante PG FPUV sin silenciar que se llevaron a cabo. Cuatro rondas de mutagénesis, colonias oscuras o tenues indican plásmidos que contienen mutaciones inactivadoras de GFP.

Esta figura representa la frecuencia de mutaciones en toda la secuencia neutra del plásmido objetivo a intervalos de 100 pares de bases. Tenga en cuenta que las mutaciones ocurren en toda la secuencia de plásmidos, pero con la frecuencia más cercana al origen de la replicación. Aquí, el crecimiento de los mutantes se muestra en función de un gradiente de fármacos.

La distancia desarrollada hacia la parte superior del gradiente indica un perfil diferencial de resistencia a los fármacos entre los mutantes. En este ejemplo, las bibliotecas de plásmidos de la oxidativa humana desmetilasa ABH dos se examinaron en busca de mutantes con mayor resistencia al sulfonato de metilmetano utilizando gradientes de selección de fármacos. Dos. Dichas bibliotecas que representan dos y cuatro iteraciones del protocolo de mutagénesis se muestran en comparación con el tipo salvaje parental y el vector vacío.

La línea blanca denota el umbral por encima del cual se aislaron las colonias mutantes individuales. Para un análisis fenotípico posterior, los mutantes betalactamasas R 1 64 H y E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R identificados previamente mediante mutagénesis P one de baja fidelidad y selección astri y m se muestran en 0,4 microgramos por mililitro y cuatro microgramos por mililitro. La protección del gradiente de cefotaxima frente a la cefotaxima es indicativa de actividad betalactamasa de espectro extendido.

Obsérvese que la enzima betalactamasa de tipo salvaje no confiere ninguna protección en relación con las células que expresan un vector vacío. Por lo tanto, estos mutantes representan la adaptación o la evolución de una nueva actividad bioquímica. Aquí hemos presentado una poderosa combinación de mutagénesis y selección funcional para esta generación de nuevas actividades bioquímicas.

Una selección funcional puede obtenerse ya sea a través de la selección de fármacos o a través de la complementación genética, y aprovecha nuestra capacidad para generar una gran diversidad genética. Es posible que la patogénesis deba restringirse a una secuencia dada para optimizar las actividades proteicas preexistentes o para la patogénesis dirigida al sitio. Esto se puede hacer fácilmente mediante clonación.

Además, la mutagénesis puede desacoplarse de una selección funcional para obtener ataques de firma o huellas mutacionales.