Name: Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a crear bibliotecas de mutantes aleatorios y realizar selecciones funcionales para evolucionar nuevas actividades enzimáticas en Escherichia coli. Este protocolo mejora la identificación de mutaciones beneficiosas.

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Este trabajo ha sido financiado por el premio K08 CA116429-04 en MC y por una beca de la Conquista del Cáncer Ahora (preocupación) base 8501 #

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

En este artículo se presenta un protocolo de mutagénesis que permite la generación de grandes bibliotecas de mutantes al azar sin la necesidad de que la clonación o la PCR. Este método se basa en propenso a errores de replicación de un plásmido que codifica una secuencia de interés. En teoría, las mutaciones se debe en gran parte limitada a los 100 a 300 pb situado inmediatamente aguas abajo del interruptor de ADN / ARN, el tamaño de la cadena líder intermedios producidos por Pol I 2,10. Hemos encontrado que en las condiciones se presentan en este protocolo, Pol mutaciones que ocurren en todo el plásmido, a pesar de la disminución en la frecuencia como la distancia a partir del plásmido aumenta ori (Figura 3). Este hallazgo implica que la transición o &quot;switch&quot; de Pol I Pol III durante la replicación del plásmido ColE1 es mucho más gradual que se informó anteriormente, por lo menos bajo condiciones experimentales dos, y está de acuerdo con estudios anteriores que sugiere una redundancia funcional entre I y Pol Pol III 11. El protocolo original describe mutagénesis en cultivos líquidos (4). Este protocolo rendimientos 0,41 mutaciones / kb para d &lt;1000, es decir, dentro de los 1000 pb al lado del ADN / ARN interruptor (Tabla 1). Hypersaturation dejando el cultivo líquido en el agitador durante 3 días sin la adición de nuevos medios de comunicación aumenta la frecuencia de mutación de 0,70 mutaciones / kb, pero los resultados en el rendimiento de plásmido muy pobres (menos del 1% en comparación con el día 1; datos no mostrados) ( Tabla 1). Aquí se presenta un protocolo simplificado basado en placas directamente la transformación de la meta del plásmido en agar sólido a 37 ° C (Figura 1). Este procedimiento produce la mayor frecuencia de mutación / ciclo de mutagénesis (0,92 mutaciones / kb para d &lt;1,000) y facilita la iteración. Cambiar las condiciones de cultivo para los medios sólidos también afecta a la mutación del espectro (Tabla 2). Mutagénesis siembra directa reduce la marcada asimetría entre los pares de bases complementarias sustituciones visto en cultivo líquido (compare C → T vs G → A y A → G vs T → C). Por otro lado, la siembra directa produce más indeles (de menos de 0,5% a 4%) y disminuyó el número de mutaciones A → G por tres veces, dando lugar a una sobrerrepresentación de G / C mutaciones (74%). En general, creemos que la mayor simplicidad y una mayor eficiencia del protocolo de siembra directa que aquí se presenta mayor que los beneficios de la mutación del espectro un poco más equilibrada producida por mutagénesis líquido. Dentro del objetivo de plásmido, las mutaciones generadas por nuestro método no se limitan a la secuencia de destino deseado. Sin embargo, la evolución de la novela de las actividades bioquímicas debe depender de las mutaciones en el gen de interés, ya que representa un salto cualitativo en lugar de un cambio cuantitativo. Por lo tanto, la combinación de nuestra mutagénesis plásmido con la detección de mutantes en las placas de gradiente aprovecha los puntos fuertes de nuestro sistema (las grandes bibliotecas, y la disponibilidad de la selección) para el desarrollo de nuevas propiedades bioquímicas. Otras aplicaciones de la mutagénesis al azar, tales como la optimización de las actuales actividades enzimáticas o asignaron al azar a las áreas específicas de un gen requieren clonación siguientes mutagénesis aleatoria. En este caso, tener la biblioteca en un plásmido en comparación con un producto de amplificación por PCR mejora la eficiencia de la clonación, al facilitar la amplificación y restricción. En resumen, hemos demostrado un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de un gen diana, ya que destaca por su sencillez y por la diversidad de las bibliotecas generado. Se muestra cómo este método puede ser, junto con las selecciones funcionales para la evolución eficiente de las nuevas actividades bioquímicas. Además, nuestro in vivo generados por las bibliotecas pueden ser fácilmente clonadas, lo que permite mutagénesis sitio-específica o la optimización de las actividades existentes.

<table><tbody><tr><td>carbenicilina</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>0.1mg/ml final</td></tr><tr><td>tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>0.05mg/ml final</td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>0.03mg/ml final</td></tr><tr><td>Agar LB Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Agar blando</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>Elaborado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Acridina naranja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Emulsión Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>Placa cuadrada de 100x100x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Placa redonda de 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Lámina para microscopio de 25x75x1 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporador 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos con separación de 2 mm</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Kit Zippy para mini preparación</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en e. coli</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

La generación eficiente de la diversidad genética representa una valiosa herramienta molecular que puede ser utilizada para etiquetar la síntesis de ADN, para crear los patrones moleculares, o para desarrollar las proteínas en el laboratorio. A continuación, presentamos un protocolo que permite la generación de gran tamaño (&gt; 10 11) bibliotecas de mutantes en una secuencia objetivo determinado. Este método se basa en la replicación de un plásmido ColE1 codificación de la secuencia deseada por una variante de baja fidelidad de la DNA polimerasa I (LF-Pol I). El objetivo del plásmido se transforma en una cepa de E. mutador coli y siembra en medio sólido, que oscilan entre un 0,2 y un mutaciones / kb, dependiendo de la localización del gen objetivo. Mayores frecuencias de mutación se logran mediante la iteración de este proceso de mutagénesis. En comparación con otros métodos de mutagénesis, el protocolo se destaca por su sencillez, como la clonación o la PCR no están involucrados. Por lo tanto, nuestro método es ideal para el etiquetado de las mutaciones de los plásmidos u otras plantillas que Pol o para explorar una gran parte del espacio de secuencias de la evolución de las actividades que no están presentes en la meta original. El estricto control espacial que la PCR o al azar oligonucleótidos basados ​​en ofrecer métodos también se puede lograr a través de la posterior clonación de las secciones específicas de la biblioteca. Aquí les ofrecemos los protocolos que muestra cómo crear una biblioteca de mutantes al azar y la forma de establecer las drogas basadas en las selecciones de E. coli para identificar mutantes presentan nuevas actividades bioquímicas.

Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

La generación eficiente de diversidad genética representa una herramienta molecular invaluable que puede utilizarse para marcar la síntesis de ADN, para crear moléculas únicas...

El objetivo general de este procedimiento es crear una biblioteca de mutantes aleatorios para una secuencia de ADN diana determinada, y para identificar y caracterizar rápidamente los mutantes mediante una selección funcional semicuantitativa. Esto se logra primero transformando un plásmido con una cepa de coli, que contiene un origen de replicación con la secuencia diana, en la cepa mutadora. Después de sembrar e incubar las células durante la noche, se recolectan y se aísla el plásmido diana para obtener la biblioteca de mutantes; luego, esta biblioteca de mutantes se transforma en una cepa indicadora para caracterizar las mutaciones en la segunda parte del protocolo. Se construye una placa de crecimiento en gradiente y cultivos bacterianos de la cepa indicadora se cargan en una placa de Petri separada que contiene agar blando.El paso final del procedimiento consiste en transferir por impresión estas culturas bacterianas al gradiente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en el perfil fenotípico de una secuencia diana determinada mediante diferencias en el crecimiento sobre un gradiente de fármaco. Este video presenta un método para la evolución dirigida de proteínas en e coli.Este proceso imita la evolución natural en la generación de bibliotecas aleatorias de nutrientes, seguida de una selección que restringe esa diversidad. De este modo, mejora nuestra capacidad para generar nuevas actividades bioquímicas con fines industriales o biomédicos. Este procedimiento tiene dos componentes: la generación de una biblioteca mutante aleatoria y la selección funcional para obtener mutaciones con ganancia de función. La persona que demostrará este procedimiento será Jennifer Allen, una técnica de mi laboratorio.Antes de comenzar este protocolo, considere células electrocompetentes JS200 que expresan una variante de baja fidelidad de la ADN polimerasa uno o pole de baja fidelidad, que previamente se han preparado según se describe en el protocolo escrito. Estas células contienen un alelo sensible a la temperatura de pole uno, de tal manera que la actividad de pole uno de baja fidelidad predomina a 37 grados Celsius. Construya un plásmido diana que contenga un origen de replicación coli uno, con la secuencia diana clonada adyacente al origen de replicación. Pole uno de baja fidelidad inicia la replicación del plásmido coli uno, introduciendo así mutaciones para iniciar la mutagénesis.Combine 40 microlitros de células electrocompetentes y entre 30 y 250 nanogramos de ADN plasmídico diana en un espacio de dos milímetros. Realice la electroforesis con un impulso vet en el electro a 1800 voltios. Verifique la constante de tiempo o TC para asegurar condiciones de transformación uniformes para cada muestra.El TC idealmente debe ser de cinco a seis milisegundos. Permita que la mezcla de ADN celular se recupere en un mililitro de caldo LB durante 40 minutos a 37 grados Celsius con agitación a 250 RPM. Obtenga una placa de Petri LV agro de 100 milímetros precalentada a 37 grados Celsius que contenga los antibióticos adecuados para seleccionar ambos plásmidos; plaque las células recuperadas a una dilución apropiada para obtener una concentración cercana a una capa continua, definida como un número distinto pero incontable de colonias como se muestra en este ejemplo.Tras la incubación nocturna, recolecte las colonias bacterianas de las placas de Petri con caldo LB. Aísle el plásmido, ADN de las células recolectadas; el plásmido resultante constituye la biblioteca de mutantes aleatorios.Realice una digestión con enzima de restricción cortando la biblioteca de plásmidos con una enzima de restricción que linealice tanto el plásmido diana como el polo. En un plásmido, realice un gel analítico de aro en el ADN plasmídico aislado para confirmar la calidad y la cantidad. Una vez verificados los plásmidos, digiera un microgramo de la biblioteca con una enzima de restricción que linealice el plásmido del polo, pero que no corte el plásmido diana.Una vez finalizada la digestión con enzima de restricción, purifique la biblioteca utilizando un kit de purificación de ADN. Finalmente, transforme la biblioteca purificada en una cepa indicadora para caracterizar las mutaciones. Para comenzar la preparación del gradiente, marque 10 carriles espaciados uniformemente a lo largo de un borde del fondo de la placa de Petri cuadrada.Coloque el plato en una inclinación de modo que el borde inferior marcado quede elevado siete milímetros. Vierta 25 mililitros de agar LB tibio mezclado bien con una concentración adecuada del agente selectivo en el plato inclinado. Esta es la capa inferior del gradiente.Asegúrese de que el agar LB cubra la placa de Petri de manera que el extremo elevado marcado de la placa contenga aproximadamente un milímetro de agar LB, y la parte inferior contenga unos ocho milímetros. Cubra la placa con la tapa KU para ventilación y deje que el agar se solidifique durante 10 a 15 minutos. Una vez que la capa inferior de agar LB se haya endurecido, traslade la placa a una superficie plana.A continuación, vierta 25 mililitros de agar LB tibio sin el agente selectivo para recubrir la superficie del primer agar, asegurándose de cubrir completamente la capa inferior. Cubra la placa con la tapa KU para ventilación y luego deje que el agar se solidifique durante 10 a 15 minutos para realizar la transferencia por estampado de bacterias. Primero, obtenga cultivos bacterianos de la cepa indicadora y dilúyalos para tener densidades celulares idénticas con una densidad óptica a 600 nanómetros menor a 1,0.A continuación, transfiera dos mililitros de agar blando líquido equilibrado a 42 grados celsius al fondo de una placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipetee 40 microlitros de la cultura bacteriana al agar blando y luego mezcle moviendo suavemente la placa. Recubra el borde largo del portaobjetos de vidrio con la mezcla de agar blando. Alinee entonces el borde recubierto del portaobjetos con la marca inferior en el recipiente con gradiente.Toque la placa con la superficie del agar. Un contacto suave es suficiente para transferir una cinta de agar blando a la superficie del gradiente. Luego, se aparta la placa para limpiarla y reutilizarla.Repita este proceso. Las muestras restantes y los controles experimentales deben incluirse en cada placa con gradiente. Si se realizan varios gradientes, incube la placa con gradiente boca abajo durante la noche a 37 grados Celsius; los tiempos y las temperaturas de incubación pueden variar según las cepas bacterianas utilizadas para la lectura, pero generalmente es suficiente una incubación nocturna a 37 grados Celsius para observar crecimiento visible.Finalmente, capture y analice el crecimiento celular según se describe en el protocolo escrito. A continuación se muestran imágenes de una cepa indicadora transformada con una biblioteca P-G-F-U-V silenciada o con una biblioteca mutante de PG FPUV que fueron procesadas. Colonias oscuras o tenues tras cuatro rondas de mutagénesis indican plásmidos que contienen mutaciones inactivadoras de GFP.Esta figura representa la frecuencia de mutaciones a lo largo de la secuencia neutra del plásmido diana en intervalos de 100 pares de bases. Obsérvese que las mutaciones ocurren en toda la secuencia del plásmido, pero con la mayor frecuencia cerca del origen de replicación. Aquí, el crecimiento de los mutantes se muestra frente a un gradiente del fármaco.La distancia crecida hacia la parte superior del gradiente indica un perfil diferencial de resistencia a fármacos entre los mutantes. En este ejemplo, bibliotecas de plásmidos de la demetilasa oxidativa humana ABH dos fueron analizadas en busca de mutantes con resistencia incrementada al metil metanosulfonato utilizando gradientes de selección con fármacos. Dos. Dichas bibliotecas, que representan dos y cuatro iteraciones del protocolo de mutagénesis, se muestran en comparación con el tipo silvestre parental y el vector vacío.La línea blanca indica el umbral por encima del cual se aislaron colonias mutantes individuales. Para análisis fenotípico adicional, se muestran mutantes de beta-lactamasa, R 1 64 H y E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, previamente identificados mediante mutagénesis con baja fidelidad P uno y selección astri y m, en gradientes de 0,4 microgramos por mililitro y cuatro microgramos por mililitro. La protección frente a cefotaxima es indicativa de actividad de beta-lactamasa de espectro extendido.Téngase en cuenta que la enzima beta-lactamasa de tipo silvestre no confiere protección alguna en comparación con las células que expresan un vector vacío. Por lo tanto, estos mutantes representan una adaptación o la evolución de una nueva actividad bioquímica. Aquí hemos presentado una combinación poderosa de mutagénesis y selección funcional para la generación de nuevas actividades bioquímicas.Una selección funcional puede obtenerse mediante selección con fármacos o mediante complementación genética, y aprovecha nuestra capacidad para generar una gran diversidad genética. La patogénesis puede tener que restringirse a una secuencia determinada para optimizar actividades proteicas preexistentes o para una patogénesis dirigida a un sitio específico. Esto puede hacerse fácilmente mediante clonación.Además, la mutagénesis puede separarse de una selección funcional para obtener ataques característicos o huellas mutacionales.

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Biología

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