Name: Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprende a evaluar bibliotecas de mutagénesis de saturación de proteínas mediante secuenciación de alto rendimiento. Este protocolo permite estudiar restricciones bioquímicas y evolutivas para la ingeniería de proteínas con funciones novedosas.

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R.R. agradece el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (RO1EY018720-05), la Fundación Robert A. Welch (I-1366) y el Centro Verde de Biología de Sistemas.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos

Aquí un protocolo se describe para la realización de la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Un aspecto importante del método es la utilización de cebadores ortogonales durante el proceso de clonación. En pocas palabras, cada posición de aminoácido es al azar por PCR mutagénico, y se mezclaron conjuntamente en grupos de posiciones cuya secuencia de longitud combinada se aloja por secuenciación de alto rend...

Mutagénesis mucho tiempo se ha empleado en el laboratorio para estudiar las propiedades de los sistemas biológicos y su evolución, y para producir proteínas o organismos mutantes con funciones mejoradas o novedosas. Mientras que los primeros enfoques se basaban en métodos que producen mutaciones aleatorias en los organismos, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante permitió a los investigadores para introducir cambios en el ADN de selección de una manera específica de sitio, es decir., Mutagénesis dirigida 1,2. Con las técnicas actuales, típicamente usando oligonucleótidos mutagénicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es relativamente fácil para crear y evaluar un número pequeño de mutaciones (por ejemplo., Mutaciones puntuales) en un gen dado 3,4. Es mucho más difícil, sin embargo, cuando los enfoques de la meta, por ejemplo, la creación de mutaciones y la evaluación de todos los posibles en un solo sitio (o de orden superior). Aunque se ha aprendido mucho desde los primeros estudios que intentan evaluar un gran número de mutations en los genes, las técnicas utilizadas eran a menudo laborioso, por ejemplo, que requiere la evaluación de cada mutación de forma independiente mediante supresor sin sentido cepas 5-7, o estaban limitados en su capacidad cuantitativa debido a la profundidad bajo la secuenciación de Sanger 8 de secuencia. Las técnicas usadas en estos estudios han sido ampliamente suplantado por métodos que utilizan la tecnología de secuenciación de alto rendimiento 9-12. Estos enfoques conceptualmente simple implican la creación de una biblioteca que comprende un gran número de mutaciones, sometiendo la biblioteca a una pantalla o de selección de función, y luego profundo-secuenciación (es decir., Del orden de&gt; 10 6 secuenciación lee) la biblioteca obtenida antes y después de la selección. De esta manera, los fenotípicas o la aptitud efectos de un gran número de mutaciones, representan como el cambio en la frecuencia de la población de cada mutante, puede evaluarse de forma simultánea y más cuantitativamente. previamente hemos introducido un simp(. es decir, todo-proteína bibliotecas de mutagénesis de saturación) enfoque le para la evaluación de las bibliotecas de todas las posibles mutaciones de un solo aminoácido en las proteínas, aplicable a los genes con una longitud más larga que la secuenciación leer longitud 11,13: En primer lugar, cada posición de aminoácido es aleatorizado por PCR dirigida al sitio mutagénico. Durante este proceso, el gen se divide en grupos compuestos de posiciones contiguas con una longitud total acomodado por la plataforma de secuenciación. Los productos de PCR mutagénicos para cada grupo se combinan entonces, y cada grupo se sometieron independientemente a la selección y secuenciación de alto rendimiento. Al mantener una correspondencia entre la ubicación de las mutaciones en la secuencia y la longitud de lectura de secuenciación, este enfoque tiene la ventaja de maximizar la profundidad de secuenciación: mientras que uno puede simplemente secuenciar tales bibliotecas en ventanas cortas sin división en grupos (por ejemplo, una escopeta estándar. enfoque de secuenciación), la mayoría lee obtenido sería de tipo salvaje y por lo tanto el mayoría de rendimiento secuenciación perdido (por ejemplo, para una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de una proteína de ácido amino 500 secuenciado en 100 aminoácidos (300 pb) ventanas, como mínimo 80% de lee será la secuencia de tipo salvaje). Aquí, un protocolo se presenta que utiliza secuenciación de alto rendimiento para la evaluación funcional de las bibliotecas de mutagénesis de saturación de toda la proteína, utilizando el enfoque anterior (descrito en la Figura 1). Es importante destacar que, se introduce el uso de cebadores ortogonales en el proceso de clonación de la biblioteca de código de barras de cada grupo de secuencias, lo que les permite ser multiplexadas en una biblioteca, se somete simultáneamente a la detección o la selección y, a continuación multiplexados DE para secuenciación profunda. Dado que los grupos de secuencias no se someten a selección de forma independiente, esto reduce la carga de trabajo y se asegura de que cada mutación experimenta el mismo nivel de selección. TEM-1 β-lactamasa, una enzima que confiere resistencia de alto nivel aantibióticos β-lactámicos (por ejemplo., ampicilina) en bacterias se utiliza como un sistema modelo 14-16. Un protocolo se describe para la evaluación de una biblioteca de mutagénesis de saturación conjunto de proteínas de TEM-1 en E. coli bajo selección en un nivel en suero aproximada para una dosis clínica de ampicilina (50 mg / ml) 17,18.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Productos de investigación Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de</td><td>Petri Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Oligonucleotide cebadores Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>escala de 25 nmol, pBR322_AvrII de desalinización estándar</td></tr><tr><td></td><td>disponibles a pedido</td><td></td><td>PBR322 plásmido modificado para contener el sitio de restricción de AvrII aguas abajo del gen TEM-1</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash; pBR322_OP5</td><td>disponible, bajo pedido</td><td></td>: <td>cinco plásmidos pBR322 modificados, cada uno con un par de sitios de cebado ortogonales</td></tr>: <tr><td>ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad</td>, <td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>incluye 5 tampones de PCR y aditivo de PCR (potenciador de GC)</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 ml,</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas multicanal (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR, 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Sello de placa de 96 pocillos</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 pocillos</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x tinte de carga de gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UV (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>tampón EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ensayo de fondo transparente de paredes negras y 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de dsDNA PicoGreen Reactivo</td> de cuantificación de dsDNA <td>Invitrogen</td><td>P7581</td>, <td>utilizado en el paso 2.2.4 del protocolo</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Victor 3 V</td> Kit de purificación de ADN <td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymo</td><td>Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador UV de longitud de onda larga</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de extracción de ADN en gel de agarosa</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 electrocompetente E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de plásmidos</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tira de PCR de 8 pocillos</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de ensayo HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA reactivo de cuantificación</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos MiSeq v2 (500 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Secuenciador de sobremesa MiSeq</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternativamente, se podría secuenciar en la plataforma Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>el software FLASh</td><td>de la Universidad John Hopkins</td>, un <td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td> <td>software de código abierto para fusionar lecturas de extremos emparejados de datos de secuenciación de próxima generación</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

un protocolo para la evaluación funcional de la proteína total-mutagénesis de saturación bibliotecas la utilización de secuenciación de alto rendimiento

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

La mutagénesis dirigida al sitio se ha utilizado durante mucho tiempo como método para interrogar la estructura, función y evolución de las proteínas. Los avances recientes en la tecnología de secuenciación masiva paralela han abierto la posibilidad de evaluar los efectos funcionales o de aptitud de un gran número de mutaciones simultáneamente. Aquí, presentamos un protocolo para determinar experimentalmente los efectos de todas las posibles mutaciones de un solo aminoácido en una proteína de interés utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento, utilizando como ejemplo la enzima de resistencia a antibióticos TEM-1 de 263 aminoácidos TEM-1 β-lactamasa. En este enfoque, se construye una biblioteca de mutagénesis de saturación de proteínas completas mediante PCR mutagénica dirigida al sitio, aleatorizando cada posición individualmente a todos los aminoácidos posibles. A continuación, la biblioteca se transforma en bacterias y se selecciona por su capacidad de conferir resistencia a los antibióticos β-lactámicos. El efecto de la aptitud de cada mutación se determina mediante una secuenciación profunda de la biblioteca antes y después de la selección. Es importante destacar que este protocolo introduce métodos que maximizan la profundidad de lectura de la secuenciación y permiten la selección simultánea de toda la biblioteca de mutaciones, mezclando posiciones adyacentes en grupos de longitud acomodados por la longitud de lectura de secuenciación de alto rendimiento y utilizando cebadores ortogonales para codificar cada grupo. Los resultados representativos utilizando este protocolo se proporcionan mediante la evaluación de los efectos de aptitud de todas las mutaciones de aminoácidos individuales en TEM-1 a una dosis clínicamente relevante de ampicilina. El método debe ser fácilmente extensible a otras proteínas para las que se haya realizado un ensayo de selección de alto rendimiento.

El mapa del plásmido para los cinco plásmidos pBR322 modificados que contienen sitios de cebado ortogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) se muestra en la Figura 2A. Para probar si los cebadores ortogonales son específicos, se realizaron PCRs utilizando todos los pares de cebadores ortogonales individualmente, junto con los cinco plásmidos pBR322_OP1-5, o con todos los plásmidos menos el plásmido que coincida con el par de cebadores ortogonal. El producto se obtuvo correcta ...

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

El objetivo general de este protocolo es describir la evaluación funcional de bibliotecas completas de proteínas de mutagénesis por saturación en un solo sitio, utilizando secuenciación de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la bioquímica y la evolución molecular. Por ejemplo, ¿cuáles son las limitaciones bioquímicas, estructurales y evolutivas de las proteínas?¿Y cómo podemos diseñar proteínas con funciones novedosas? La principal ventaja de esta técnica es que maximiza un número de lecturas de secuenciación útiles en un estudio de mutagénesis por saturación de proteínas completas, mediante la construcción y secuenciación de bibliotecas multiplexantes. Después de preparar una placa de PCR Master Mix de acuerdo con el protocolo del texto, utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de las placas de 96 pocillos que contienen los cebadores de mutagénesis sensorial previamente diluidos a los pocillos afines en las placas de PCR.Utilice un sello de placa para cubrir cada placa de PCR y centrifugar a 200 G durante dos minutos. A continuación, transfiera las placas de PCR a un termociclador y ejecute el siguiente progra

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Biología

Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja...

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

Los modelos de proteinopatía de levadura son herramientas valiosas para evaluar la toxicidad y la agregación de proteínas implicadas en la enfermedad. Aquí, presentamos métodos para la detección de supresores de toxicidad en bibliotecas de variantes de Hsp104. Este protocolo podría adaptarse para analizar cualquier biblioteca de proteínas en busca de supresores de toxicidad de cualquier proteína que sea tóxica en la levadura.

Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Este manuscrito describe los protocolos clínicos para dos paneles de secuenciación de próxima generación. Un panel interroga a las neoplasias malignas hematológicas, mientras que el otro panel se centra en los genes comúnmente mutados en tumores sólidos. La clasificación molecular de las mutaciones impulsoras en las neoplasias malignas humanas ofrece información pronóstica y predictiva valiosa.

Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

Resistencia a los medicamentos para terapias dirigidas es generalizada y la necesidad de identificar mecanismos de resistencia - antes o después de la aparición clínica - es fundamental para guiar las estrategias de gestión clínica alternativas. A continuación, presentamos un protocolo para acoplar derivación de líneas resistentes a los fármacos in vitro con la secuenciación para acelerar el descubrimiento de estos mecanismos.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

Las proteínas que se unen a secuencias específicas de RNA desempeñan papeles críticos en la expresión génica. Caracterización detallada de estos sitios de Unión es crucial para nuestra comprensión de la regulación génica. Aquí, se describe un enfoque solo paso para la mutagénesis de la saturación de los sitios de unión a proteínas en el ARN. Este enfoque es relevante para todos los sitios de unión a proteínas en el ARN.

Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora

Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

Las personas con mutaciones BRCA1 tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer, lo que garantiza una evaluación precisa de la función de las variantes brca1. En este documento, describimos un protocolo para la evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base de citosina mediadas por CRISPR que permiten la conversión de C:G a T:A dirigida en células vivas.

Evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base mediados por CRISPR

Aprende a evaluar bibliotecas de mutagénesis de saturación de proteínas mediante secuenciación de alto rendimiento. Este protocolo permite estudiar restricciones bioquímicas y evolutivas para la ingeniería de proteínas con funciones novedosas.

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