Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

El objetivo general de este protocolo es describir la evaluación funcional de bibliotecas completas de proteínas de mutagénesis por saturación en un solo sitio, utilizando secuenciación de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la bioquímica y la evolución molecular. Por ejemplo, ¿cuáles son las limitaciones bioquímicas, estructurales y evolutivas de las proteínas?

¿Y cómo podemos diseñar proteínas con funciones novedosas? La principal ventaja de esta técnica es que maximiza un número de lecturas de secuenciación útiles en un estudio de mutagénesis por saturación de proteínas completas, mediante la construcción y secuenciación de bibliotecas multiplexantes. Después de preparar una placa de PCR Master Mix de acuerdo con el protocolo del texto, utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de las placas de 96 pocillos que contienen los cebadores de mutagénesis sensorial previamente diluidos a los pocillos afines en las placas de PCR.

Utilice un sello de placa para cubrir cada placa de PCR y centrifugar a 200 G durante dos minutos. A continuación, transfiera las placas de PCR a un termociclador y ejecute el siguiente programa. Después de realizar una PCR adicional y diluir las reacciones, de una a 100, transfiera un microlitro de los productos de PCR mutagénicos de primera ronda mezclados y diluidos a los pocillos afines de las nuevas placas de PCR que contienen Master Mix.

Utilice un sello de placa para cubrir cada placa de PCR. Centrifugar las placas a aproximadamente 200 Gs durante dos minutos. A continuación, transfiera las placas al termociclador y ejecute el mismo programa mencionado anteriormente en el vídeo.

Después de verificar los tamaños de los productos de PCR y medir las concentraciones de acuerdo con el protocolo de texto, mezcle 100 nanogramos de cada producto de PCR de la subbiblioteca NNS en cinco grupos de subbibliotecas NNS. Después de ejecutar las reacciones de PCR de la subbiblioteca y digerir los vectores de clonación en las reacciones de PCR, de acuerdo con el protocolo de texto, configure las reacciones de ligadura siguiendo estas pautas para cada grupo de subbiblioteca NNS digerido, con su vector de clonación digerido de restricción afín. Luego, incube a temperatura ambiente durante una hora.

Una vez que se hayan descongelado las células electrocompetentes de E. coli, agregue diez microlitros de células a cada reacción de ligadura purificada y transfiérala a una cubeta de electroprorrateo. Electroprorratee las celdas a 1,8 kilovoltios, luego agregue un mililitro de medio SOB e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Luego, vuelva a suspender 10 microlitros de cada cultivo de recuperación en 990 microlitros de LB. Y esparcir 100 microlitros en placas de barrena LB que contengan 12 microgramos por mililitro de tetraciclina.

Por cada cultivo de recuperación, prepare un matraz de cultivo de 250 mililitros con 50 mililitros de LB y 50 microlitros de caldo de agua. Transfiera el aproximadamente un mililitro restante de cultivo de recuperación a un matraz. Incubar a 37 grados centígrados y 200 rpm durante la noche.

Después de contar el número de transformantes exitosos en las placas y aislar el ADN plasmático de los cultivos nocturnos, mezcle 100 nanogramos de cada plásmido. Después de transformar la biblioteca de ADN de acuerdo con el protocolo de texto, diluya la referencia cultural de la biblioteca durante la noche a un OD-600 igual a 0,1. Y agregue un mililitro a un matraz.

Incubar el cultivo de preselección a 37 grados centígrados y 200 RPM. Monitoree periódicamente el crecimiento midiendo el OD-600, hasta que sea igual a 0.1. Transfiera 100 mililitros del cultivo de preselección a dos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 4.000 Gs durante seis minutos, a cuatro grados centígrados.

Retire la mayor parte del sobrenadante y combine los gránulos en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Luego, después de repetir la centrifugación, retire todo el sobrenadante. A los otros dos frascos, añadir tetraciclina hasta una concentración final de 12 microgramos por mililitro.

Y un volumen del cultivo de preselección, tal que el OD-600 final es igual a 0,001. A un matraz, agregue un mililitro de 50 miligramos por mililitro de ampicilina a una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Esta es la cultura de la selección.

Mientras incuba los cultivos a 37 grados centígrados en 200 RPM, controle el crecimiento del cultivo que no contiene ampicilina hasta que alcance un OD-600 igual a 0,1. Mida también el OD-600 de la cultura de selección. Después de dividir el OD-600 del cultivo de selección en 0,1 y multiplicarlo por 100, transfiera este volumen a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 4.000 Gs y cuatro grados centígrados durante seis minutos.

Después de eliminar la mayor parte del sobrenadante, combine los gránulos en un solo tubo antes de volver a girar y eliminar todo el sobrenadante. Para llevar a cabo una secuenciación de alto rendimiento, prepare una mezcla maestra de PCR y transfiera 23 microlitros a 10 tubos de PCR. Agregue un microlitro de 0,5 nanogramos por microlitro de ADN plásmido purificado del cultivo de preselección a los tubos del uno al cinco.

Y del cultivo de selección a los tubos seis a 10. Mezcle 50 microlitros de cebadores ortogonales frontales de 50 micromolares, OP1F a OP5F, con los respectivos cebadores ortogonales inversos, OP1R a OP5R. En el mismo orden, transfiera un microlitro a los tubos de PCR del uno al cinco y del seis al 10.

Transfiera los tubos de PCR al termociclador y ejecute el siguiente programa. A continuación, diluya las reacciones de PCR 100 veces, transfiriendo un microlitro de cada tubo a 99 microlitros de agua. Mezcle bien, luego pipetee 99 microlitros de los tubos y deséchelo.

Mezcle 50 microlitros de los cebadores delanteros y sus respectivos imprimadores traseros. Luego, transfiera un microlitro a los tubos de PCR del uno al cinco y del seis al 10. Luego, después de preparar una mezcla maestra de PCR, agregue 23 microlitros a cada tubo de PCR y ejecute el siguiente programa.

Para llevar a cabo las PCR finales para agregar secuencias de indexación, después de diluir las reacciones de PCR 100 veces, como antes, y mantener un microlitro, agregue 23 microlitros de la PCR Master Mix. En el caso de los tubos con plantilla que se originan en los grupos de subbibliotecas NNS del uno al cinco, añada 0,5 microlitros de cebadores directos 501F a 505F, respectivamente. Para tubos con plantilla resultante de los cultivos de preselección y selección, añadir 0,5 microlitros de cebadores inversos 701R y 702R.

Ejecute el mismo programa de PCR que se acaba de indicar. Luego, después de medir las concentraciones de cada reacción de acuerdo con el protocolo de texto, mezcle 100 nanogramos de cada producto de PCR en un solo tubo de microcentrífuga. Después de agregar un tinte de carga de gel 6X, cargue toda la muestra de PCR combinada en un gel de agarosa al dos por ciento.

Y haga funcionar el gel a 100 voltios, durante 50 minutos. Usando un iluminador UV de longitud de onda larga, visualice y luego extirpe el corte que contiene el producto de PCR de aproximadamente 360 pares de bases. Purifique, secuencie y analice la muestra de acuerdo con el protocolo de texto.

Aquí se muestra el mapa de plásmidos para los cinco plásmidos pBR322 modificados que contienen sitios de cebado ortogonales. Las pruebas de especificidad de los cebadores ortogonales mediante PCR mostraron que el producto de PCR correcto solo se obtuvo cuando se incluyó el plásmido correspondiente en la reacción. Y en su ausencia no se obtuvo ningún producto de ningún tamaño.

Tras el procesamiento de un experimento, se obtuvieron 6,2 veces 10 a la sexta lecturas de la condición de preselección, y 6,3 veces 10 a la sexta lectura de la condición de ampicilina. Los recuentos de cada mutación de aminoácidos de la condición de preselección muestran una distribución logarítmica normal. Esta figura muestra el efecto de aptitud relativa, FIA, para cada mutación en cada posición de TEM-one.

Y su distribución se muestra aquí. Bajo la selección de 50 microgramos por mililitro de ampicilina, la mayoría de las mutaciones tienen un efecto de aptitud neutro, o casi neutro. Correspondiente a los píxeles blancos aquí, y al pico grande aquí.

Una pequeña fracción de las mutaciones a esta concentración de antibiótico tienen efectos sustanciales sobre la aptitud. Como era de esperar, estas incluyen mutaciones dentro de los residuos del sitio activo altamente conservados. Por el contrario, pocos píxeles aparecen tan significativamente rojos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana. Si se realiza correctamente y todos los reactivos están disponibles. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantenerse organizado durante la clonación para combinar los productos de PCR mutagénicos en los grupos correctos y clonar en los vectores correctos.

Y durante la preparación de la secuenciación, utilizar los cebadores correctos. A partir de este procedimiento, los pasos principales del protocolo podrían modificarse para examinar las combinaciones de mutaciones, los diferentes entornos de selección y otros sistemas de proteínas, con el fin de responder a preguntas adicionales sobre la dependencia genética y ambiental del contexto de las mutaciones. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión del trabajo necesario para construir una biblioteca de mutagénesis de saturación de proteínas completas y para evaluar los efectos funcionales de cada mutación simultáneamente, utilizando la secuenciación de alto rendimiento.

No olvide que trabajar con bromuro de etidio y luz ultravioleta puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes, bata de laboratorio y protector UV al realizar partes de este protocolo.