Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

El objetivo de este procedimiento es recolectar imágenes en serie a través de una región específica del tejido cerebral utilizando el haz de iones enfocado y el microscopio electrónico de barrido. Esto se logra primero seccionando el cerebro en rodajas que se tiñen y luego se incrustan con resina. El segundo paso es cortar la región de interés de la sección del cerebro incrustada y montarla en un bloque de resina en blanco.

El tercer paso es recortar el bloque de resina con un ultra micrótomo y utilizar el haz de iones del microscopio para aislar sólo la región que se va a fotografiar. El paso final es crear una imagen en serie de una cara del bloque de resina utilizando el haz de iones para eliminar repetidamente las capas finas antes de tomar cada imagen. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran imágenes en serie a través de una región de interés.

La serie de imágenes se recopila automáticamente y el conjunto de datos suele tener vóxeles isotrópicos para que las estructuras de las imágenes se puedan ver desde cualquier ángulo de la pila. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la microscopía electrónica de transmisión de sección en serie, es que es capaz de lograr una resolución Z mucho mayor. Y en comparación con la tomografía electrónica, es capaz de obtener imágenes de volúmenes mucho mayores con una resolución óptima para muestras incrustadas en resina.

El procedimiento comienza con la disección del cerebro fijo de una rata perfundida anestesiada. Incruste el cerebro en un molde de plástico cálido al 5%aeros, oriente el cerebro al ángulo correcto antes de que el conjunto de aros se solidifique, monte el bloque aeros con el cerebro adentro en un soporte de muestras usando una rebanada de vibrato. Las secciones coronales de 80 micras cortan tantas secciones como sean necesarias para incluir la región de interés.

A continuación, coloque las muestras en viales de aislamiento de vidrio de 20 mililitros. Coloque hasta 10 secciones por vial. Enjuague las muestras tres veces durante cinco minutos cada una con tampón de K coate 0,1 molar.

A continuación, tiñir las muestras con cianuro de potasio al 1,5 % y tetróxido de osmio al 1 % en tampón de K coate de K 0,1 molar durante 30 minutos. Continúe tiñendo las muestras con tetróxido de osmio al 1% en tampón de K 0,1 molar durante 30 minutos. Después de esto, enjuague una vez con agua destilada doble durante tres minutos, luego manche con acetato de aluminio al 1% en agua destilada doble durante 30 minutos.

A continuación, enjuague las secciones durante cinco minutos en agua destilada doble y luego deshidrátelas en una serie de alcohol graduado, dejando dos minutos para cada cambio. El siguiente paso es incrustar las secciones en concentraciones crecientes de resina Duran mezclada con alcohol, dejando 30 minutos entre cambios. Comience con 50 a 50 de etanol a resina, luego de 30 a 70, luego de 10 a 90, finalmente en las secciones a 100% de resina durante 30 minutos.

A continuación, sustituya el medio por resina duran 100% fresca. Agite lentamente durante una hora en la batidora de rodillos. Después de la incrustación, use un palito de cóctel de madera para colocar las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio que hayan sido previamente recubiertos con agentes separadores de moldes.

Coloque tantas secciones en los toboganes como sea posible, pero tenga cuidado de no abarrotar los toboganes. Asegúrese de que también se coloque una etiqueta de identificación entre los portaobjetos del microscopio. Coloque los portaobjetos en un horno a 65 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, retira las muestras del horno. Empuje suavemente una hoja de afeitar entre los portaobjetos de vidrio del microscopio y retire la capa de resina que contiene las muestras de entre los portaobjetos, sujetando la capa de resina con los dedos. Lave suavemente la muestra con agua corriente.

Para eliminar cualquier agente separador de moldes, coloque la muestra bajo un microscopio de disección con iluminación transmitida utilizando un objetivo de baja potencia. Marque la región de interés con una aguja fina. Usa una cuchilla de afeitar para cortar un pequeño cuadrado de tres milímetros por tres milímetros alrededor de la región de interés.

Usa pegamento acrílico para unir el pequeño bloque de resina a la parte superior de un bloque de resina en blanco. A continuación, sujete el bloque en el soporte del ultra micrótomo. Mirando a través del microscopio estereoscópico adjunto, use una hoja de afeitar para recortar alrededor de la región de interés hasta que solo quede una pequeña pirámide de material.

Corta el borde del bloque cerca de la región de interés en ángulo con la superficie superior del bloque con un cuchillo de vidrio fijado al ultra micrótomo. Recorte aún más el bloque para que la región de interés se pueda ubicar con precisión con respecto a las dimensiones de la superficie del bloque. Retire el bloque del ultra micrótomo y colóquelo bajo un microscopio de luz transmitida.

Fotografía la región de interés. Usa una sierra de joyero para cortar el bloque recortado del trozo de resina restante con pintura al carbón. Pegue el bloque de apagado SA en un portamuestras SEM y oriéntelo de modo que el lado que se va a fotografiar quede orientado hacia el borde más externo.

Después de que el pegamento se haya secado, transfiera la preparación a un sistema de evaporación en forma de media luna y al vacío y cubra el bloque con una capa delgada de oro de más de 20 nanómetros. El bloque de tejido incrustado en resina ya está listo para ser visualizado en el microscopio electrónico de barrido con haz de iones enfocado. Inserte la muestra en su soporte en el microscopio a bajo aumento y, utilizando imágenes electrónicas secundarias, oriente el bloque de modo que la región de interés y el lado del bloque que se va a obtener la imagen estén enfrentados.

El operador orienta el bloque de modo que la cara que se va a visualizar quede paralela a la viga de fresado. Esto da como resultado que el haz de electrones se oriente a 54 grados con respecto a esta cara utilizando una corriente de haz de iones de 13 a 27 nanoamperios. A 30 kilovoltios.

Retire una banda estrecha de resina de la parte frontal de la región que se va a fotografiar. A continuación, cambie al modo de imagen dispersa posterior para ver la cara fresada que se superpone a la región de interés. Usando la imagen de referencia de microscopía óptica tomada anteriormente y la imagen de la cara fresada, localice la región exacta en el bloque que se va a fresar y obtenga imágenes utilizando el sistema de inyección de gas del microscopio.

Deposite una capa protectora de alrededor de una micra de espesor de carbono o metal sobre la superficie del bloque por encima de la región de interés utilizando una corriente de 700 picoamperios. Finalmente, muela la región del bloque dentro de la cual se tomarán las imágenes finales. Permita que la viga de fresado muerde completamente esta cara de la imagen hasta que no se puedan ver artefactos de fresado en la cara.

Seleccione los parámetros del microscopio para la obtención de imágenes en serie de la cara. Los parámetros típicos son voltajes entre 1,2 y dos kilovoltios con tamaños de píxel entre cuatro y 20 nanómetros. El tiempo de permanencia de los píxeles debe ser de unos 10 microsegundos, de modo que el tiempo total para fresar la cara y adquirir una imagen sea inferior a dos minutos.

Deje reposar el microscopio durante al menos dos horas para cualquier cambio térmico. Para disipar, inicie el proceso de fresado y generación de imágenes para adquirir imágenes en serie a través de la región de interés. Esta figura muestra la imagen retrodispersa de contraste inverso de la cara del bloque que muestra la ultra estructura dentro de una región del cerebro envolvente.

Todas las membranas son visibles, así como las grandes estructuras macromoleculares. Esta figura se compone de un total de 1.600 imágenes recopiladas a un espaciado de cinco nanómetros, lo que da como resultado una pila de imágenes con vóxeles isotrópicos. Esta pila se puede visualizar en cualquier plano con la misma resolución.

Entonces, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar el tejido cerebral para la obtención de imágenes en serie con el microscopio electrónico de barrido centrado en el haz.