Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral
6 de julio de 2011
Este protocolo describe cómo resina incrustada tejido cerebral puede ser preparado y fotografiado en las tres dimensiones en el haz de iones enfocado, microscopio electrónico de barrido.
El objetivo de este procedimiento es obtener imágenes en serie a través de una región específica del tejido cerebral utilizando un microscopio de barrido con haz de iones enfocado y un microscopio electrónico de barrido. Esto se logra primero seccionando el cerebro en cortes que se tiñen y luego se incluyen en resina. El segundo paso consiste en cortar la región de interés del corte cerebral incluido y montarla sobre un bloque de resina vacío.
El tercer paso consiste en recortar el bloque de resina con un ultramicrótomo y utilizar el haz de iones del microscopio para aislar únicamente la región que se desea imaginar. El paso final es obtener imágenes en serie de una cara del bloque de resina utilizando el haz de iones para eliminar repetidamente capas delgadas antes de cada toma de imagen. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren imágenes en serie a través de una región de interés.
La serie de imágenes se recopila automáticamente y el conjunto de datos suele tener vóxeles isotrópicos, de modo que las estructuras de la imagen se pueden visualizar desde cualquier ángulo en la pila. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía electrónica de transmisión de secciones seriadas es que puede alcanzar una resolución Z mucho mayor. Y en comparación con la tomografía electrónica, es capaz de imaginar volúmenes mucho más grandes con una resolución óptima para muestras embebidas en resina.
El procedimiento comienza con la disección del cerebro fijado de una rata perfundida y anestesiada. Incruste el cerebro en agar al 5 % caliente dentro de un molde de plástico, oriente el cerebro al ángulo correcto antes de que el agar se solidifique y monte el bloque de agar con el cerebro en el interior sobre un portaobjetos utilizando una vibrátomo. Corte secciones coronales de 80 micrómetros, tantas secciones como sean necesarias para incluir la región de interés.
A continuación, coloque las muestras en viales de vidrio aislantes de 20 mililitros. Coloque hasta 10 secciones por vial. Lave las muestras tres veces durante cinco minutos cada vez con tampón K coate 0,1 molar.
Luego, tiña las muestras con cianuro de potasio al 1,5% y tetraóxido de osmio al 1% en tampón K coate 0,1 molar durante 30 minutos. Continúe tiñendo las muestras con tetraóxido de osmio al 1% en tampón K coate 0,1 molar durante 30 minutos. A continuación, enjuague una vez con agua doblemente destilada durante tres minutos y luego tiña con acetato de aluminio al 1% en agua doblemente destilada durante 30 minutos.
A continuación, lave las secciones durante cinco minutos con agua doblemente destilada y luego deshidrátelas mediante una serie de alcoholes graduados, permitiendo dos minutos por cada cambio. El siguiente paso consiste en incluir las secciones en concentraciones crecientes de resina Duran mezclada con alcohol, dejando 30 minutos entre cada cambio. Comience con una proporción de 50 a 50 de etanol a resina, luego 30 a 70, después 10 a 90, y finalmente coloque las secciones en resina al 100 % durante 30 minutos.
Luego, reemplace el medio con resina duran fresca al 100 %. Agite lentamente durante una hora en el mezclador rotatorio. Después del incluido, utilice un palillo de madera para colocar las secciones sobre portaobjetos de vidrio que previamente hayan sido recubiertos con agentes separadores de molde.
Coloque tantas secciones como sea posible sobre los portaobjetos, pero tenga cuidado de no sobrecargarlos. Asegúrese de colocar también una etiqueta identificativa entre los portaobjetos. Coloque los portaobjetos en un horno a 65 grados Celsius durante 24 horas.
Al día siguiente, retire las muestras del horno. Empuje suavemente una cuchilla de afeitar entre las laminillas de vidrio del microscopio y retire la capa de resina que contiene las muestras de entre las laminillas, sosteniendo la capa de resina con los dedos. Lave suavemente la muestra bajo agua corriente.
Para eliminar cualquier agente separador de moho, coloque la muestra bajo un microscopio estereoscópico con iluminación transmitida utilizando un objetivo de baja potencia. Marque la región de interés con una aguja fina. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar un cuadrado pequeño de tres milímetros por tres milímetros alrededor de la región de interés.
Utilice pegamento acrílico para fijar el bloque pequeño de resina en la parte superior de un bloque de resina virgen. A continuación, sujete el bloque en el portamuestras del ultramicrotomo. Mirando a través del microscopio estereoscópico acoplado, use una cuchilla de afeitar para recortar alrededor de la región de interés hasta que solo quede una pequeña pirámide de material.
Corte el borde del bloque cerca de la región de interés en un ángulo con respecto a la superficie superior del bloque utilizando un cuchillo de vidrio fijado al ultramicrotomo. Recorte aún más el bloque para que la región de interés pueda localizarse con precisión respecto a las dimensiones de la superficie del bloque. Retire el bloque del ultramicrotomo y colóquelo bajo un microscopio de luz transmitida.
Fotografíe la región de interés. Utilice una sierra de joyero para cortar el bloque recortado del resto del tallo de resina con pintura de carbono. Adhiera el bloque SA al soporte de muestra para SEM y oriente de modo que el lado que se va a imaginar quede frente al borde más externo.
Después de que el pegamento se haya secado, transfiera la preparación a un sistema de evaporación en creciente y al vacío y recubra el bloque con una capa delgada de oro mayor de 20 nanómetros. El bloque de tejido embebido en resina ya está listo para ser observado en el microscopio electrónico de barrido con haz de iones enfocado. Inserte la muestra en su portaobjetos dentro del microscopio con baja ampliación y, utilizando la imagen de electrones secundarios, oriente el bloque de modo que la región de interés y el lado del bloque que se va a observar queden enfrentados.
El operador orienta el bloque de modo que la cara que se va a imaginar quede paralela al haz de fresado. Esto provoca que el haz de electrones se oriente a 54 grados respecto a esta cara, utilizando una corriente de haz iónico de 13 a 27 nanoamperios a 30 kilovoltios.
Retire una banda estrecha de resina del frente de la región que se va a imaginar. A continuación, cambie al modo de imagen con electrones retrodispersados para visualizar la cara tallada que subyace a la región de interés. Utilizando la imagen de referencia de microscopía óptica tomada anteriormente y la imagen de la cara tallada, localice la región exacta del bloque que se va a tallar e imaginar mediante el sistema de inyección de gas del microscopio.
Deposite una capa protectora de aproximadamente un micrón de espesor de carbono o metal sobre la superficie del bloque por encima de la región de interés utilizando una corriente de 700 picoamperios. Finalmente, fresque la región del bloque dentro de la cual se tomarán las imágenes finales. Permita que el haz de fresado fresque completamente esta cara de imagen hasta que no se observen artefactos de fresado en la superficie.
Seleccione los parámetros del microscopio para la obtención de imágenes en serie de la superficie. Los parámetros típicos son voltajes entre 1,2 y dos kilovoltios con tamaños de píxel entre cuatro y 20 nanómetros. El tiempo de permanencia del píxel debe ser de aproximadamente 10 microsegundos, de modo que el tiempo total para mecanizar la superficie y adquirir una imagen sea inferior a dos minutos.
Deje que el microscopio repose durante al menos dos horas para que se estabilicen los cambios térmicos. Para disipar, inicie el proceso de molienda y adquisición de imágenes para obtener imágenes en serie a través de la región de interés. Esta figura muestra la imagen de electrones retrodispersados con contraste invertido de la cara del bloque, que revela la ultraestructura dentro de una región del cerebro envuelto.
Todas las membranas son visibles, así como las estructuras macromoleculares grandes. Esta figura está compuesta por un total de 1.600 imágenes recopiladas con un espaciado de cinco nanómetros, lo que resulta en una pila de imágenes con vóxeles isotrópicos. Esta pila puede ser imagenada en cualquier plano con la misma resolución.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar tejido cerebral para imágenes en serie con el microscopio electrónico de barrido de haz enfocado.
Resumen
Este protocolo describe la preparación y obtención de imágenes de tejido cerebral embebido en resina en tres dimensiones mediante un microscopio electrónico de barrido con haz de iones enfocado. El método permite la obtención de imágenes de alta resolución de regiones cerebrales específicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Histología
Antecedentes
- La microscopía electrónica de haz de iones enfocados ofrece ventajas frente a los métodos tradicionales de imagen.
- Proporciona una mayor resolución en el eje Z y puede obtener imágenes de volúmenes más grandes de muestras embebidas en resina.
- Esta técnica es particularmente útil para estudiar la arquitectura del tejido cerebral.
- La adquisición de imágenes en serie permite un análisis exhaustivo de la región de interés.
Objetivo del estudio
- Recopilar imágenes seriadas de tejido cerebral para un análisis estructural detallado.
- Demostrar un método que mejora la resolución de imágenes y la capacidad de volumen.
- Facilitar el estudio de regiones cerebrales específicas en un contexto tridimensional.
Métodos Utilizados
- Diseción e inclusión del tejido cerebral en resina.
- Seccionado seriado y tinción de cortes cerebrales.
- Recorte y montaje del bloque de resina para la obtención de imágenes.
- Obtención de imágenes mediante microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado.
Resultados principales
- Recolección exitosa de imágenes seriadas a través de la región de interés.
- Obtención de imágenes de alta resolución con vóxeles isotrópicos.
- Capacidad demostrada para visualizar estructuras desde múltiples ángulos.
- Los resultados muestran una mejora significativa respecto a los métodos tradicionales de imagen.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la obtención de imágenes de tejido cerebral embebido en resina.
- La microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado es efectiva para estudios estructurales detallados.
- Esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de la organización del tejido cerebral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado (FIB/SEM) permite la obtención de imágenes 3D de tejido cerebral con resolución elevada y vóxeles isotrópicos tan pequeños como 4 nm, lo que posibilita un análisis ultraestructural detallado. Esta capacidad mejora la validación de objetivos en el descubrimiento de fármacos en neurociencia al proporcionar información mecanicista sobre la arquitectura celular y la patología. El método aumenta la confianza predictiva en los modelos preclínicos al permitir la visualización de estructuras tisulares desde múltiples ángulos sin artefactos por seccionado.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización detallada de la ultraestructura celular y de los complejos macromoleculares.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al revelar dianas estructurales en su contexto tisular nativo.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en la diana al permitir el análisis del tejido desde cualquier ángulo de visión dentro de la serie de imágenes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce conjuntos de datos de imágenes estandarizados y reproducibles adecuados para análisis morfométrico cuantitativo.
- Escalabilidad: Permite la obtención de imágenes de volúmenes mayores que la tomografía electrónica con resolución óptima para muestras embebidas en resina.
- Reutilización de plataforma: Genera pilas de imágenes en serie que pueden ser reanalizadas para múltiples objetivos o vías.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la fidelidad estructural desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante una resolución isotrópica de vóxeles.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Clarifica las relaciones entre estructura y función en el tejido cerebral para orientar la selección de dianas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o detener mediante la provisión de datos estructurales de alta fidelidad sobre sistemas relevantes para la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La FIB/SEM se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana de objetivos hasta la obtención de imágenes preclínicas, permitiendo análisis estructurales que aportan información para la identificación de compuestos prometedores y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al visualizar estructuras subcelulares en volúmenes de tejido intactos.
- Tamizaje: Proporciona conjuntos de datos cuantitativos e isotrópicos en 3D que permiten la comparación confiable de fenotipos estructurales entre diferentes condiciones.
- Análisis: Ofrece imágenes en serie con resolución a escala nanométrica, lo que permite mediciones morfométricas precisas y análisis estadísticos de la arquitectura tisular.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos estructurales en fase de descubrimiento con modelos preclínicos mediante imágenes de alta resolución y consistentes de tejido cerebral.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen reutilizable para estudios longitudinales del compromiso de dianas terapéuticas y la respuesta del tejido.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios de tejido cerebral.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y la estandarización mediante flujos de trabajo automatizados de corte e imagen en series sucesivas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir imágenes de gran volumen con alta resolución, reduciendo la necesidad de múltiples técnicas complementarias.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos estructurales detallados sobre la interacción con el objetivo y la patología tisular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de histología, inclusión en resina y microscopía electrónica.
- Depende del acceso a microscopios electrónicos de barrido con haz de iones enfocado que cuenten con sistemas de inyección de gas y recubrimiento.
- Necesita estandarización entre equipos para los protocolos de preparación de muestras, tinción e inclusión.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes regiones cerebrales o modelos de enfermedad.
- Incluye limitaciones prácticas, como tiempos prolongados de procesamiento y la necesidad de un recubrimiento conductor previo a la obtención de imágenes.
