Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Nuestra investigación se centra en la conectómica. Desarrollamos metodologías de adquisición óptica o de imágenes electrónicas de alto rendimiento, que permiten el análisis de un circuito neuronal y de las características de conectividad sináptica para descifrar la lógica fundamental de conexión de los circuitos neuronales. La conectómica original de alta revolución está limitada a pequeños volúmenes cerebrales debido a la costosa adquisición de datos y precisión, mientras que el análisis microscópico rápido y el estudio microscópico dirigido ofrecen potencial para conectómica cerebral completa.

En comparación con otros enfoques microscópicos, como varios microscopios Larsens, OMLIT captura imágenes de todas las neuronas con información de preocupación de dendritas y axones. Además de su compatibilidad con microscopio electrónico, existe más imágenes de resolución nanométrica bajo EF. OMLIT ayuda a construir modelos cerebrales completos, mapeando todas las proyecciones a largo plazo, incluyendo su dirección, intensidad y tipo, junto con los microcircuitos locales en combinación con temas seriales. Ofrece una visión de la arquitectura estructurada y el flujo de información en todo el cerebro.

Estamos desarrollando imágenes automatizadas de OMLIT y adquisición de datos EM guiadas por IR definidas por OMLIT, lo que permite la recogida y análisis eficiente de datos conectómicos a través de volúmenes cerebrales grandes o completos. Para empezar, selecciona película capton o D50 con un grosor de 50 micrómetros y montada en el sistema de bobinado motorizado. Utilizando un sistema de pulverización magnetrón de doble cabeza, deposita una película fina uniforme de cromo u otros metales como aluminio, plata o cobre sobre la superficie de la cinta.

Coloca la cinta a una distancia de 80 milímetros del objetivo que falla. Realizar el proceso con corriente continua y a una presión de un pascal regulada por gas argón al 99,99%. Ahora, ajusta la velocidad de enrollado de la cinta a 0,6 milímetros por segundo para lograr un grosor metálico de 50 nanómetros.

Tras la deposición, retira la cinta del sistema una vez que se haya enfriado a temperatura ambiente. Evalúa el grosor y la uniformidad del recubrimiento, utilizando un perfilador de aguja, microscopía de fuerza atómica o microscopía electrónica de barrido. Para una estrategia de baja reflectividad, limpia y vuelve la cinta hidrofila usando un limpiador de plasma a 80 vatios de potencia mientras mueves la cinta a siete milímetros por segundo.

Tras el tratamiento, coloca gotas de agua sobre la superficie de la cinta para confirmar que se extienden rápidamente en una película fina. Usando una pequeña amoladora o herramienta de corte similar, recorta la resina en el lado de la muestra para eliminar la resina en blanco circundante y exponer el área de la muestra. Coloca el bloque de resina incrustado en el portamuestras y apriétalo para asegurar bien el bloque.

Monta el portamuestras en el brazo móvil del microtomo. Instala un cuchillo de cristal o un cuchillo de recorte de diamante en un ángulo de 45 grados sobre el soporte del cuchillo. Bajo el microscopio, recorta la superficie de la muestra en forma de pirámide y alisa, luego recorta y alisa los cuatro lados del bloque de muestra para eliminar el exceso de resina.

Gira el mando para alinear los bordes delantero y trasero del bloque en posición horizontal. Retira el cuchillo de recorte y reemplázalo por uno de diamante, colocado en un ángulo de 45 grados. Ajusta el ángulo de inclinación de la base del microtomo a seis grados y mueve el portacuchillos lentamente usando el mando hasta que el filo delantero del cuchillo esté a uno o dos milímetros de la superficie de la muestra.

Observa la banda brillante entre la superficie de la muestra y el filo de la cuchilla, y ajusta el ángulo de inclinación para que la banda quede pareja de arriba a abajo y de lado a lado. Ahora, inyecta agua destilada en la ranura del cuchillo de diamante para humedecer la hoja. Retira un poco de agua con una jeringuilla hasta que el nivel de líquido baje y el reflejo parezca plateado.

A continuación, ajusta el grosor de la sección, la velocidad de corte y la ventana de corte en la unidad de control. Ajusta la velocidad de sección a 0,6 milímetros por segundo y el grosor de la sección a 60 nanómetros, dependiendo de la calidad de la muestra. Comienza a seccionar con el microtomo.

Una vez producidas secciones estables y uniformes, se pausa el proceso. Luego usa un pincel fino para eliminar secciones cortadas y restos. Ahora instala tanto el carrete de cinta recubierta como el carrete de recogida vacío en el sistema automático de recogida de sección ultra fina.

Fija el mecanismo de bloqueo y realiza una prueba para confirmar un movimiento suave de la cinta a velocidad constante y la correcta recogida en el carrete de recogida. Sumerge la cabeza de recogida del dispositivo de recogida con cinta en el baño de agua del cuchillo de diamante y ajusta la cabeza para que quede paralela al filo del cuchillo a 1,5 veces la longitud de la rebanada de la muestra. Asegura el dispositivo de recogida y reanuda la sección, mientras ejecutas simultáneamente el dispositivo de recogida de cinta.

Después de recoger suficientes secciones continuas, pausa la sección. Corta la cinta en un área sin secciones. Activa el dispositivo de recogida de cinta hasta que toda la cinta esté enrollada en el carrete.

Después, quita el carrete y colócalo en un horno electrónico de secado. Limpia el dispositivo de recogida de cinta y el microtomo y vuelve todos los accesorios a su lugar correspondiente. Para montar en una oblea de silicio, despega la película protectora transparente de la cinta conductora de doble cara.

Aplica la cinta paralela a la cinta conductora de doble cara, colocando hasta tres segmentos de cinta en cada pieza. Coloca la oblea de silicio en el escenario del microscopio óptico y fíjala con cinta adhesiva que no deje residuos. Utiliza una lente objetivo de cinco X para obtener una imagen general de la oblea de silicio, la cinta y la muestra.

En la imagen general, haz un esquema de cada sección y ordénalas, luego añade puntos de enfoque y exposición para realizar imágenes automáticas a una ampliación de 20 o 50 X en toda la oblea. Después de la imagen, guarda las imágenes y comprueba su calidad, reenfocando y reimaginando si alguna está desenfocada o de mala calidad. Importa la pila de imágenes TIFF a VAST 22 seleccionando importar, seguido de importar volumen de imágenes de imágenes a archivo VSV.

Conecta una tableta externa y usa la herramienta de pincel y dibuja el modo segmentar para segmentar y trazar manualmente las estructuras. Usa las teclas de acceso directo A y Z para navegar entre las porciones de imagen. Ahora, visualiza la estructura segmentada en tres dimensiones seleccionando ventana, seguida de un visor 3D, vista y actualización.

Finalmente, guarda los resultados de la segmentación tras seleccionar archivo y guardar segmentación. En las imágenes de alta reflectividad, las regiones de luz citoplasmática y vascular mostraron mayor intensidad en comparación con las áreas circundantes, mientras que en las imágenes de baja reflectividad, las regiones de luz citoplasmática y vascular mostraron menor intensidad. Los resultados cuantificados demostraron que las estrategias de alta y baja reflectividad.

Cada uno tenía ventajas en términos de contraste y entropía de información. La microscopía óptica OMLIT permitió identificar axones, vasos sanguíneos, cuerpos celulares y dendritas. La segmentación manual de imágenes de tortillas, utilizando VAST, mostró numerosos cuerpos celulares, dendritas y axones ordenados de forma estrecha.

Los resultados segmentados se combinaron con la imagen original para producir una visualización tridimensional. Las imágenes ampliadas de OMLIT mostraron una resolución insuficiente para revelar estructuras más finas. Las imágenes de microscopía electrónica de la misma región revelaron sinapsis, mitocondrias, núcleos celulares y vesículas.