Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para
5 de mayo de 2014
Este protocolo se describe la configuración de un microscopio de lámina de luz y su aplicación para la visualización in vivo de C. elegans embriones.
El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del desarrollo de C Allergan mediante microscopía de hoja de luz por fluorescencia. Esto se logra primero configurando el microscopio basado en hoja de luz, compuesto por un microscopio invertido y un pequeño conjunto de elementos optomecánicos para generar una hoja de luz. El segundo paso del procedimiento consiste en montar el embrión.
Los últimos pasos consisten en ajustar la lámina de luz sobre el embrión y registrar su desarrollo. Los resultados pueden mostrar la dinámica de proteínas marcadas con fluorescencia durante el desarrollo de C. elegans mediante el análisis de videos en 3D y de lapsos de tiempo. Las principales ventajas de la microscopía de lámina de luz frente a otros métodos existentes, como la microscopía confocal, son que permite un imagenado más rápido con menor fototoxicidad.
En tercer lugar, este método puede proporcionar información sobre el sello frente al desarrollo. También puede aplicarse a otros sistemas, como el pez cebra o el roil. La demostración del procedimiento será clara.
Shales, un ingeniero de mi laboratorio, y Pauline Linac, una ingeniera del laboratorio de van. Esta sección describe el montaje del conjunto, el cual puede dejarse armado para todos los experimentos. Una vez que los láseres, filtros, telescopio y periscopio hayan sido colocados sobre la mesa óptica, fije la lente cilíndrica para generar la lámina de luz.
Se ajusta una lente diferente para enfocar. El punto focal del objetivo de iluminación debe coincidir con el punto focal objeto del objetivo de detección. Ahora, proyecte el haz sobre la pared o pantalla y mueva el objetivo de iluminación a lo largo del eje del haz hasta que los contornos de la proyección estén nítidos.
Incluya un filtro de emisión de cuatro líneas y una cámara E-M-C-C-D en el montaje del microscopio. Fije el segundo estadio de traslación manual al primero de forma perpendicular. Sujete el conjunto al estadio del microscopio existente mediante tornillos.
Después de retirar el objetivo de iluminación con lente cilíndrica fijado, coloque el conjunto en el microscopio y vuelva a colocar el sistema de iluminación sobre las platinas. Fije el soporte del qve en la intersección perpendicular entre la trayectoria de iluminación y la trayectoria de detección. Ahora, verifique la lámina de luz.
Llene un vete de vidrio con solución de fluoresceína y colóquelo en el soporte sobre las platina. La lámina de luz debe ser visible. Debe estar horizontal y centrada con respecto al objetivo de detección.
A continuación, retire la lente cilíndrica. Optimice la lámina de luz mediante la traslación tridimensional del objetivo de iluminación y adquiera una imagen para medir el grosor de la lámina de luz. Esto depende de la apertura del objetivo.
Luego, asegúrese de reemplazar la lente cilíndrica. Primero, corte un trozo de vidrio de un milímetro de espesor, de 10 milímetros por 20 milímetros. Utilice un rotulador de diamante.
A continuación, agregue 20 microlitros de poli-L-lisina a un lado y, una vez seco, colóquelo adyacente a un segundo portaobjetos. En una posición fija, agregue una gota de agar al 5 % y alísele con el peso de un tercer portaobjetos colocado encima. Después de que el agar se seque, retire el tercer portaobjetos y corte la almohadilla de agar a tres milímetros del borde de los dos portaobjetos restantes sobre el portaobjetos sin poli-L-lisina.
Luego retire el portaobjetos fijado, dejando un extremo sobresaliente de agar. Recubra el agar con 20 microlitros de poli-L-lisina y deje secar. Ahora coloque los gusanos GR en un vidrio de reloj lleno con medio M nueve bajo un microscopio de disección.
Corte los gusanos con un escalpelo a la altura de la vulva, liberando así los huevos. Luego identifique los embriones que se encuentren en la etapa de interés y recójalos con una pipeta capilar de micro. Transfiera los embriones al saliente de agar que sobresale del portaobjetos preparado, justo al lado del borde del portaobjetos, no en el límite del agar.
Luego alinee los embriones con una pipeta de microcapilar mientras retira el líquido. Por aspiración, los embriones se adherirán a la poliol lisina. Es muy importante colocar bien los embriones para obtener una buena grabación, y esto requiere una micropipeta con la apertura adecuada.
Si es demasiado pequeño, será difícil liberar los embriones. Si es demasiado grande, será difícil controlar con precisión el flujo de fuga y alinear los embriones. Cubra la placa con medio M nueve en una placa de Petri y confirme que los embriones aún estén adheridos al agar usando ampliación. Ahora, fije la placa preparada con embriones al soporte de muestra que encaja en un vete.
El soporte es un dispositivo fabricado internamente que está diseñado para ajustarse a un vete. A continuación, fije el vete a una plataforma piezoeléctrica y, bajo iluminación de campo claro, localice un embrión. Ahora inicie el paquete de software que controla el filtro acusto-óptico sintonizable.
Filtre la cámara y la platina. Este software fue desarrollado internamente, pero también se puede utilizar el software gratuito MicroManager. Primero, seleccione la línea láser.
A continuación, ajuste la platina a lo largo del eje x hasta que la lámina de luz esté en su punto máximo de brillo. Luego, ajuste las otras dos dimensiones, Y y Z, hasta que la relación señal-ruido sea óptima. Esto podría necesitar repetirse para cada embrión.
Esta clave permite optimizar la relación señal-ruido para obtener una grabación adecuada mediante la traslación de una etapa libre, el soporte del objetivo y su eliminación cuando existe una simple relación para lograr una simulación continua del embrión y el mejor contraste. Ahora, adquiera imágenes de lapso de tiempo y ajuste la potencia del láser, el tiempo de exposición, la ganancia y el intervalo de adquisición de imágenes según el nivel de fluorescencia del embrión y la velocidad del proceso biológico analizado. Para Zack.
La adquisición de imágenes estableció la distancia entre las secciones y sus posiciones inicial y final en C. elegans que expresaba un constructo de histona GFP. Se realizó una adquisición de imágenes con intervalos de tiempo de dos horas, tomando 20 pilas de secciones cada 37 segundos. Las divisiones celulares fueron claramente visibles en una cepa que expresaba tubulina fusionada a GFP y histona fusionada a mCherry. Las grabaciones se realizaron durante 16 minutos cada 105 segundos.
Se muestran representaciones tridimensionales en tres puntos temporales. Los husos mitóticos y los cromosomas condensados son claramente visibles y fáciles de rastrear durante las divisiones celulares. En una tercera cepa, la lipoproteína APO vit dos fusionada a GFP se visualizó con etiquetado de mCherry en la membrana celular.
En más de 13 minutos, se tomaron 10 pilas de cortes cada 27 segundos. Las partículas de lipoproteínas de movimiento rápido fueron fáciles de seguir. Aquí utilizamos la lámina de luz formada mediante métodos más complejos para producirla.
La lámina de luz podría implementarse para mejorar aún más la resolución espacial.
Descripción general
Este protocolo describe la configuración de un microscopio de hoja de luz y su implementación para la obtención de imágenes in vivo de embriones de C. elegans. El método permite una adquisición de imágenes más rápida con menor fototoxicidad en comparación con la microscopía confocal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- microscopía
Antecedentes
- La microscopía de hoja de luz proporciona un enfoque único para la obtención de imágenes de muestras biológicas.
- Esta técnica es particularmente útil para observar embriones vivos.
- Minimiza el daño fotónico mientras permite una adquisición de imágenes rápida.
- Las aplicaciones se extienden a diversos organismos modelo más allá de C. elegans.
Objetivo del estudio
- Visualizar el desarrollo de embriones de C. elegans mediante microscopía de hoja de luz con fluorescencia.
- Analizar la dinámica de proteínas marcadas con fluorescencia durante el desarrollo.
- Mostrar las ventajas de la microscopía de hoja de luz frente a los métodos tradicionales.
Métodos Utilizados
- Configuración de un microscopio de hoja de luz con elementos optomecánicos.
- Montaje de embriones en portaobjetos preparados con almohadillas de agar.
- Optimización del alineamiento de la hoja de luz para la adquisición de imágenes.
- Adquisición de imágenes de lapso de tiempo de embriones para capturar procesos de desarrollo.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de divisiones celulares y dinámica de proteínas en embriones de C. elegans.
- Se obtuvieron representaciones tridimensionales de husos mitóticos y cromosomas.
- Se demostró la capacidad de rastrear proteínas de movimiento rápido.
- Proporcionó información sobre los procesos de desarrollo del organismo.
Conclusiones
- La microscopía de hoja de luz es una herramienta poderosa para la imagen en vivo.
- Este método mejora la comprensión del desarrollo embrionario.
- Se puede adaptar para su uso con otros organismos modelo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de hoja de luz permite la obtención de imágenes de alto rendimiento con baja fototoxicidad en el desarrollo de organismos completos, lo que apoya la validación de objetivos en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar datos fenotípicos dinámicos y cuantitativos. Este enfoque reduce la incertidumbre biológica en modelos preclínicos al permitir el seguimiento longitudinal de procesos celulares y de la dinámica de proteínas en sistemas vivos. El método mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al ofrecer resultados de imagen reproducibles y escalables, compatibles con flujos de trabajo de cribado de alto contenido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización con resolución subcelular de la dinámica de proteínas y las divisiones celulares en embriones en desarrollo.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de fenotipos del desarrollo en condiciones de baja fototoxicidad.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al generar conjuntos de datos longitudinales y multiparamétricos que correlacionan perturbaciones moleculares con resultados del desarrollo.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Proporciona imágenes estandarizadas en 3D con resolución subcelular y lapse de tiempo, lo que permite evaluar de manera confiable los efectos de compuestos en contextos de organismo completo.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante un alineamiento y estabilización precisos del plano de iluminación, minimizando la variabilidad en sesiones de imagen longitudinal.
- Escalabilidad: Compatible con cámaras de observación de múltiples pocillos y control automatizado de la platina, lo que permite campañas de cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir una evaluación fenotípica consistente en diferentes sistemas modelo mediante protocolos de imagen estandarizados.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite la observación directa de los efectos del acoplamiento al blanco sobre los procesos de desarrollo, reduciendo la ambigüedad en los estudios del mecanismo de acción.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona umbrales cuantitativos para decisiones de avance o interrupción basadas en métricas de toxicidad del desarrollo y normalización fenotípica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la optimización del fármaco líder, ofreciendo una modalidad de imagen cuantitativa no destructiva para cribados fenotípicos y estudios mecanicistas en modelos de organismo completo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir el seguimiento en tiempo real de proteínas y estructuras celulares marcadas con fluorescencia durante la embriogénesis.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la preparación estandarizada de portaobjetos, caracterización de láminas de luz y protocolos de montaje de embriones que aseguran la consistencia en la obtención de imágenes.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas en 3D y con lapse de tiempo (por ejemplo, dinámica del huso mitótico, tráfico de proteínas) que permiten comparaciones objetivas entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar lecturas fenotípicas relevantes para enfermedades en C. elegans, un modelo validado para vías del desarrollo conservadas.
- Reutilización Empresarial: Diseñado como un sistema modular ensamblado a la izquierda sobre una mesa óptica, lo que permite su uso repetido en diversos proyectos con mínima recalibración.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la observación directa y longitudinal de la dinámica proteica y el comportamiento celular.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante procedimientos estandarizados de alineación optomecánica, preparación de portaobjetos y montaje de embriones.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de toxicidad en el desarrollo, reduciendo la eliminación tardía debida a riesgos biológicos no identificados.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar puntuaciones fenotípicas cuantitativas basadas en imágenes que informan las decisiones de avance en diferentes clases de objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica, microscopía de fluorescencia y preparación de muestras para imágenes en vivo.
- Necesita una mesa óptica estable, fuentes láser, objetivos, platina de traslación y una cámara EM-CCD o sCMOS para la detección.
- Exige la estandarización entre equipos en la preparación de portaobjetos, el estadio de los embriones y los parámetros de imagen para garantizar la reproducibilidad entre usuarios y sitios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el tamaño del embrión, la clarificación óptica y la compatibilidad del medio de montaje al extenderse a otros sistemas modelo (por ejemplo, pez cebra, Drosophila).
- Las limitaciones prácticas incluyen la eficiencia de inmovilización de los embriones y la uniformidad del plano de luz en grandes campos de visión, lo que puede requerir optimización para sesiones de imagen más prolongadas.
