Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para En Toto Imágenes de C. elegans Desarrollo
5 de mayo de 2014
Este protocolo se describe la configuración de un microscopio de lámina de luz y su aplicación para la visualización in vivo de C. elegans embriones.
El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del desarrollo de C Allergan utilizando microscopía de lámina de luz de fluorescencia. Esto se logra configurando primero el microscopio basado en lámina de luz compuesto por un microscopio vertical y un pequeño conjunto de elementos optomecánicos para generar una lámina de luz. El segundo paso del procedimiento es montar el embrión.
Los últimos pasos son ajustar la lámina de luz sobre el embrión y registrar su desarrollo. Los resultados pueden mostrar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia durante el desarrollo de CL egan a través del análisis de videos en 3D y lapsos de tiempo. Las principales ventajas de la microscopía de barco de luz sobre otros métodos existentes, como la microscopía confocal, es que permite obtener imágenes más rápidas con menor fototoxicidad.
En tercer lugar, este método puede proporcionar información sobre la foca contra el desarrollo. También se puede aplicar a otros sistemas como el turbulencia o el pez cebra. La demostración del procedimiento será clara.
Shales, ingeniera de mi laboratorio, y Pauline Linac, ingeniera del laboratorio de furgonetas. En esta sección se describe el ensamblaje de configuración y se puede dejar ensamblado para todos los experimentos. Una vez que los láseres, los filtros, el telescopio y el periscopio se hayan colocado en la mesa óptica, asegure la lente cilíndrica para generar la lámina de luz.
Se ajusta una lente diferente para el enfoque. El punto focal del objetivo de iluminación debe coincidir con el punto focal del objeto del objetivo de detección. Ahora, proyecte el haz en la pared o pantalla y mueva el objetivo de iluminación a lo largo del eje del haz hasta que los contornos de la proyección sean nítidos.
Incluya un filtro de emisión de cuatro líneas y una cámara E-M-C-C-D en la configuración del microscopio. Fije la segunda etapa de traducción manual a la primera de manera perpendicular. Atornille el conjunto a la platina del microscopio existente.
Después de retirar el objetivo de iluminación de la lente cilíndrica establecido, coloque el conjunto en el microscopio y vuelva a colocar el conjunto de iluminación en las platinas. Coloque el soporte qve en la intersección perpendicular de la ruta de iluminación y la ruta de detección. Ahora, revisa la hoja de luz.
Llene un vaso con solución de fluoresceína y colóquelo en el soporte de las tarimas. La hoja de luz debe ser visible. Debe estar horizontal y centrado con respecto a la lente del objetivo de detección.
A continuación, retire la lente cilíndrica. Optimice la lámina de luz con la traducción 3D del objetivo de iluminación y adquiera una imagen para medir el grosor de la lámina de luz. Esto depende de la apertura de la lente del objetivo.
Luego, asegúrese de reemplazar la lente cilíndrica. Primero, corte un trozo de vidrio de un milímetro de grosor, de 10 milímetros por 20 milímetros. Usa un rotulador de diamante.
A continuación, añade 20 microlitros de lisina poli L a un lado y, una vez seco, yuxtapónelo a un segundo portaobjetos. En una posición fija, agregue una gota de agar al 5% y alísela con el peso de un tercer portaobjetos colocado en la parte superior. Después de que el agar se seque, retire el tercer portaobjetos y corte la almohadilla de agar a tres milímetros del borde de los dos portaobjetos restantes sobre el portaobjetos sin poli L lisina.
A continuación, retire el portaobjetos fijo, dejando un saliente de agar. Cubra el agar con 20 microlitros de lisina poli L y deje que se seque. Ahora coloque gusanos GR en un vidrio de reloj lleno de medio M nine bajo un microscopio de disección.
Corta los gusanos con un bisturí a la altura de la vulva, liberando así los huevos. A continuación, identifique los embriones que se encuentran en la etapa de interés y recójalos con una pipeta microcapilar. Transfiera los embriones al saliente de agar del portaobjetos preparado, justo al lado del borde del portaobjetos, no en el borde del agar.
A continuación, alinee los embriones con una pipeta microcapilar mientras se extrae el líquido. Por aspiración, los embriones se adherirán al poliol lisina. Es muy importante posicionar bien los embriones para obtener un buen registro, y esto requiere un capilar con la apertura adecuada.
Si es demasiado pequeño, será difícil liberar los embriones. Si es demasiado grande, será difícil controlar estrictamente el flujo filtrado y alinear los embriones. Cubra el portaobjetos con medio M nine en una placa de Petri y confirme que los embriones aún están unidos al agar usando aumento. Ahora, fije el portaobjetos preparado con embriones al portamuestras que encaja en un vete.
El soporte es un artilugio de fabricación propia que está diseñado para adaptarse a un veterinario. A continuación, asegure el vete a una etapa eléctrica Pizo y, bajo iluminación de campo claro, localice un embrión. Ahora ponga en marcha el paquete de software que controla la óptica acústica sintonizable.
Filtra la cámara y el escenario. Este software aquí fue escrito internamente, pero también se puede usar el software gratuito de micromanager. Primero, seleccione la línea láser.
A continuación, ajuste la etapa a lo largo del eje x hasta que la hoja de luz esté en su punto más brillante. A continuación, ajuste las otras dos dimensiones, Y y Z, hasta que la relación señal/ruido esté en su mejor momento. Es posible que sea necesario repetir esto para cada embrión.
Esta es clave para optimizar la relación señal-señal para obtener una buena grabación que se traduzca en la de una etapa libre, apoyando el objetivo de eliminación y eliminación cuando solo se relaciona para obtener una simulación del embrión y el mejor contraste. Ahora adquiera imágenes de lapso de tiempo y configure la potencia del láser, la exposición, la ganancia de tiempo y el intervalo de imagen de acuerdo con el nivel de fluorescencia del embrión y la velocidad del proceso biológico analizado. Para Zack.
Las imágenes establecen la distancia entre los cortes y sus posiciones inicial y final en c elgan que expresa una construcción GFP de histonas. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de dos horas con 20 pilas de cortes tomadas cada 37 segundos. Las divisiones celulares fueron claramente visibles en una cepa que expresaba tubulina fusionada con GFP y su piedra fusionada con m cherry Las grabaciones se tomaron durante 16 minutos cada 105 segundos.
Las representaciones 3D se muestran en tres puntos temporales. Los husos mitóticos y los cromosomas condensados son claramente visibles y fácilmente rastreables a través de las divisiones celulares. En una tercera cepa, se obtuvieron imágenes de la lipoproteína APO vit dos fusionada a GFP con marcaje mCherry de la membrana celular.
Durante 13 minutos, se tomaron 10 pilas de cortes cada 27 segundos. Las partículas de lipoproteínas que se movían rápidamente eran fáciles de seguir. Aquí utilizamos la lámina de luz formada por métodos más complejos para producir.
La lámina de luz puede implementarse para mejorar aún más la resolución espacial.
Visión general
Este protocolo describe la configuración de un microscopio de lámina de luz y su implementación para la imagen in vivo de embriones de C. elegans. El método permite una imagen más rápida con menor fototoxicidad en comparación con la microscopía confocal.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biofísica
- Microscopía
Antecedentes
- La microscopía de lámina de luz proporciona un enfoque único para la imagen de muestras biológicas.
- Esta técnica es particularmente útil para observar embriones vivos.
- Minimiza el fotodaño mientras permite una imagen rápida.
- Las aplicaciones se extienden a varios organismos modelo más allá de C. elegans.
Propósito del estudio
- Visualizar el desarrollo de embriones de C. elegans utilizando microscopía de lámina de luz fluorescente.
- Analizar la dinámica de proteínas marcadas con fluorescencia durante el desarrollo.
- Demostrar las ventajas de la microscopía de lámina de luz sobre los métodos tradicionales.
Métodos utilizados
- Configuración de un microscopio de lámina de luz con elementos optomecánicos.
- Montaje de embriones en portaobjetos preparados con almohadillas de agar.
- Optimización de la alineación de la lámina de luz para la imagen.
- Imagen de lapso de tiempo de embriones para capturar procesos de desarrollo.
Principales resultados
- Imagen exitosa de divisiones celulares y dinámica de proteínas en embriones de C. elegans.
- Se obtuvieron representaciones 3D de huso mitótico y cromosomas.
- Se demostró la capacidad de rastrear proteínas de movimiento rápido.
- Se proporcionaron conocimientos sobre los procesos de desarrollo del organismo.
Conclusiones
- La microscopía de lámina de luz es una herramienta poderosa para la imagen in vivo.
- Este método mejora la comprensión del desarrollo embrionario.
- Puede adaptarse para su uso con otros organismos modelo.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
