Imágenes de alta resolución de C. elegans en todas las etapas larvales

En el laboratorio trabajamos en todo tipo de preguntas de biología del desarrollo. Yo mismo trabajo más en el aspecto técnico, desarrollando métodos para abordar mejor estas preguntas utilizando técnicas de imagen. El campo de C. elegans ha adoptado con éxito una gran variedad de métodos, que van desde la edición de genes CRISPR, la transcriptómica y la proteómica, hasta la microscopía de súper resolución. C. elegans es un modelo asombroso, sin embargo, en el contexto de la observación in vivo a alta resolución, viene con sus desafíos, requiriendo inmovilización para una mejor resolución, lo que a su vez limita la viabilidad animal. El protocolo presenta una posible solución para las imágenes de C. elegans a largo plazo, lo que permite a los investigadores adoptar el método en su propio laboratorio y estudiar una amplia variedad de procesos dinámicos de desarrollo directamente in vivo. Dentro del laboratorio, el método ha permitido una observación detallada de la formación de órganos, por ejemplo, en el contexto de la morfogénesis o después de las divisiones de células somáticas en la edad adulta. Desde entonces, el método ha sido adoptado por numerosos laboratorios que estudian una amplia gama de procesos de desarrollo.

[Presentador] Para comenzar, conecte el dispositivo al marco de soporte y móntelo en el microscopio vertical. Llene una jeringa con agua desionizada, luego conecte una aguja de calibre 23 y una pieza larga de tubo de una por 16 pulgadas con un pasador de acero hueco doblado. Llene el tubo con agua desionizada de la jeringa e inserte el pasador de acero en el orificio perforado de la entrada de la válvula para conectar el tubo. Retire la jeringa y la aguja antes de conectar el tubo al solenoide fuera de chip. Usando el software de imágenes, encienda el solenoide y presurice el dispositivo durante varios minutos para expulsar todo el aire de la válvula. Verifique la finalización verificando visualmente que la interfaz aire-agua aparezca oscura y desaparezca en el material PDMS. Apague el solenoide con el software de imágenes. Luego, llene una jeringa de un mililitro con la solución de bacterias filtrada y conecte una aguja de calibre 30 y un trozo largo de tubo de una por 32 pulgadas a la aguja. Presione el émbolo para llenar tanto la aguja como el tubo conectado con la solución bacteriana. Luego, con unas pinzas, inserte el tubo de 32 pulgadas directamente en la entrada de alimentos del dispositivo microfluídico y coloque la jeringa en la bomba de jeringa. Presione el émbolo de la jeringa con el tornillo de mariposa en la parte posterior para llenar el dispositivo con líquido. Bloquee tanto la entrada como la salida del tornillo sin fin con pasadores de acero sellados y aplique presión adicional con el tornillo de fijación para eliminar el aire restante del dispositivo. Luego retire el pasador de acero bloqueado en la salida y coloque el contenedor de desechos en la salida. Empuje la jeringa para asegurarse de que el contenedor de residuos esté correctamente conectado y que no existan obstrucciones en el sistema. Retire el segundo pasador de acero bloqueado de la entrada y empuje la jeringa hasta que aparezca una pequeña gota de líquido en la entrada del gusano. Luego, con una aguja de calibre 23, conecte una pieza más larga de un tubo de 16 pulgadas que mida aproximadamente de 15 a 20 centímetros a una jeringa de un mililitro llena de tampón basal S. Coloca un pasador de acero recto de calibre 23 en el otro extremo del tubo. Llene la aguja y el tubo con tampón basal S de la jeringa. Ahora, inserte el pasador de acero en el extremo del tubo en el tubo que contiene los gusanos y empuje una pequeña cantidad de líquido a través del tubo para asegurarse de que no quede aire. Tire de los gusanos hacia el tubo sin meterlos en la jeringa. Luego empuje la jeringa conectada a los gusanos hasta que aparezca una pequeña gota de líquido en el pasador de acero e inserte el pasador de acero en la entrada del gusano del dispositivo microfluídico. Coloque el dispositivo en un microscopio con bajo aumento, ya sea 5x o 10x, o en un microscopio de disección. Coloque el dispositivo de manera que la entrada sea visible en un lado del campo de visión y la parte posterior de la entrada del canal de trampa sea visible en el otro lado. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa de gusano. A continuación, empuje a los animales hacia la matriz de canales. Una vez que un animal mire hacia el canal, empújelo en el canal y repita para animales adicionales. Después de atrapar suficientes animales, coloque la jeringa, aún unida a la entrada del gusano, en la platina del microscopio, donde permanecerá durante todo el experimento. Si la carga se realizó en un microscopio de disección, transfiera el dispositivo al microscopio de imágenes. Ahora, encienda la bomba de jeringa y hágala funcionar a una velocidad preestablecida de un microlitro por hora durante 0,5 microlitros. Programe la bomba de jeringa de modo que funcione a un microlitro por hora durante 0,5 microlitros, después de lo cual el caudal se incrementa en 100 microlitros por hora durante 0,5 microlitros, y el patrón de flujo se repite durante todo el experimento. Coloque el dispositivo en la platina del microscopio y asegúrese de que esté firmemente sujeto. Cambie a la ampliación de imagen deseada. Identifique los animales y las regiones de interés dentro de la matriz de canales de trampa y configure las condiciones de imagen deseadas. Imagen en las condiciones de imagen deseadas, accionando la válvula en chip a través del solenoide 10 segundos antes de la adquisición de la imagen para que los animales se mantengan en su lugar. El dispositivo microfluídico mantuvo una alta calidad de imagen en varias modalidades de microscopía, incluidos los métodos de campo claro, epifluorescencia, confocal de disco giratorio y súper resolución debido al uso de una cubierta de vidrio de 170 micrómetros de espesor. Desarrollo de células epiteliales de Caenorhabditis elegans visualizadas desde la etapa larvaria L1 temprana hasta la etapa larvaria L2 media. Se evidenció la inducción de las células precursoras primarias de la vulva descoloridas y sus divisiones posteriores desde la etapa larvaria L1 tardía hasta la L4 temprana. Etapas de formación de la vulva desde el L3 temprano hasta la edad adulta. Las imágenes adquiridas se mejoraron mediante la deconvolución y el registro de imágenes, mejorando la claridad visual. Las divisiones celulares observadas ocurrieron de manera consistente y oportuna en todos los animales con todas las divisiones completadas dentro de las duraciones típicas de las etapas larvarias. La longitud de las gónadas aumentó constantemente durante las etapas L2 y L3 con mediciones consistentes habilitadas por la orientación recta de los animales.