HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células presentadoras de antígeno artificiales o una A PC para la expansión ex vivo de CTL humanos específicos para antígenos, con posible uso en inmunoterapia adoptiva. Esto se logra primero conjugando HLA A dos IG y anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano a microesferas magnéticas Dyna para crear una A PC. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar control de calidad y carga de péptidos en la A PC. El tercer paso del procedimiento es aislar células T CD8 positivas de sangre periférica humana. El paso final del procedimiento es incubar las células T CD8 positivas con una A PC durante una semana.

Luego se cosechan los CTL y se caracterizan antes de ser utilizados o volver a estimularlos durante otra semana para alcanzar el nivel deseado de su especificidad y expansión. Finalmente, se pueden obtener resultados de tinción o de teum que muestran que los CTL expandidos en presencia de A A PC presentan una especificidad antigénica aumentada. Hoy voy a mostrarles un sistema A A PC basado en HI IG y cómo utilizar este sistema para expandir eficientemente CTL humanos específicos contra el CMV exvivo en comparación con otros métodos existentes.

Nuestra tecnología A A PC ofrece varias ventajas importantes. Está disponible comercialmente, se dispone de ella en cantidad ilimitada y, digamos, A A PC puede utilizarse para todos los donantes HRAA dos positivos. Bien, comencemos: transfiera un mililitro de perlas de epoxi M cuatro 50 de un stock con aproximadamente 400 millones de perlas a un tubo de vidrio estéril con rosca.

Lave las perlas una vez añadiendo un mililitro de tampón boid y luego colocando el vial de vidrio contra un imán NBC uno mientras las perlas se adhieren al costado del vial. Retire el sobrenadante por aspiración. Suspender las perlas en una mezcla de tampón boid, dímero HLA A2-Ig y anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano.

Luego, para facilitar la conjugación de la proteína con las perlas, gire el vial de vidrio en un rotador a cuatro grados Celsius durante 24 horas. A continuación, coloque el tubo en un imán MPC uno y retire todo el tampón borato. Una vez eliminado el tampón, lave las perlas dos veces con un mililitro de tampón de lavado de perlas.

Ahora incube las perlas en un mililitro de tampón de lavado de perlas y rote el vial a cuatro grados Celsius durante otras 24 horas para bloquear los sitios residuales de unión a proteínas en las perlas. Luego, retire el tampón del vial de vidrio y sustitúyalo con un mililitro de tampón de lavado de perlas fresco. Transfiera 100 microlitros de tampón de lavado de fax a tubos de fax y, a continuación, agregue cinco veces 10 a la quinta perlas.

Coloree las perlas con un microlitro de IgG anti ratón PE y un microlitro de IgG anti ratón AFite después de colorear durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Añada tres mililitros de tampón de lavado FACS a cada una de las muestras de tinción. Luego, haga el pellet de las APC mediante centrifugación a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Suspenda los A A PC en tampón de fax fresco y lea inmediatamente el resultado de tinción mediante citometría de flujo. Lave las perlas dos veces con PBS estéril como antes. A continuación, cargue las perlas con 10 microlitros de péptido de CMV.

Contar las perlas mediante hemocitómetro y luego etiquetarlas con la fecha y la concentración de las perlas, en perlas por mililitro. Incubar las APC con el péptido durante al menos tres días a cuatro grados Celsius. Centrifugar aproximadamente 100 mililitros de sangre periférica fresca de un donante positivo para HLA-A2 en tubos vacutainer con heparina sódica al 10 % a 300 ×g durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, retire cuidadosamente la capa superior de plasma mediante aspiración. Sustituya el plasma recolectado por PBS estéril y transfiera la sangre a un frasco de cultivo estéril T 75. Mezcle bien la sangre y el PBS mediante pipeteo una vez que toda la sangre haya sido recolectada en 15 mililitros del fial pack más cuatro tubos cónicos de 50 mililitros.

Coloque lentamente 30 a 35 mililitros de las células sanguíneas encima del fial en cada tubo. Manteniendo la interfase bien definida entre el fial y las células sanguíneas, centrifugue el gradiente de sangre y fial a 500 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente, con el freno desactivado y la aceleración lo más baja posible para mantener una interfase clara entre las capas tras la centrifugación. Aspire cuidadosamente la capa superior de plasma y luego use una pipeta serológica para extraer con cuidado la capa de PBMC. Transfiera los PBMC a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Una vez que se hayan recolectado todos los PBMC, añada 30 mililitros de PBS a las células y centrifúguelas.

A continuación, deseche el sobrenadante y lave el sedimento una vez más con 30 mililitros de PBS para eliminar el residuo de fi call, luego enriquezca la población de linfocitos T CD8 positivos utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8 positivos humanos Milton según el protocolo del fabricante. Cuente los linfocitos T CD8 positivos y confirme la pureza mediante análisis de fax.

Suspenda 1 millón de CTL en ocho mililitros de medio de cultivo con factor de crecimiento para linfocitos T 2x más ocho mililitros de medio RPMI completo y agregue 1 × 10⁶ de la mezcla de APC. Luego, utilice una pipeta multicanal para sembrar 160 microlitros de células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U. Incube las células a 37 grados Celsius en un 5 % de dióxido de carbono durante siete días.

Alimente las células el día cuatro con 80 microlitros por pocillo de medio de cultivo con factor de crecimiento para linfocitos T. Recolecte las células el día siete y luego coloque el tubo contra el imán para eliminar el A A PC viejo cuando todas las perlas se adhieran a la pared del vial.

Recolecte y transfiera las células a otro tubo cónico de 50 mililitros y cuente el número de células. Determine la especificidad del antígeno de la A A PC mediante tinción con tetrámero según el protocolo del fabricante. Repita el cultivo de las células recolectadas con nuevas A A PC en las mismas condiciones para aumentar el número de células con especificidad para el antígeno.

A continuación se muestra un resultado representativo de tinción con tetrámeros de CTL específicos contra CMV generados por A A PC tras una semana de cultivo. Se presenta aquí un resultado representativo de tinción de citocinas intracelulares de CTL específicos contra CMV generados por A-A-P-C. La especificidad contra CMV fue del 61 % según la tinción con tetrámeros. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de los linfocitos T, como por ejemplo cómo podemos identificar las condiciones óptimas de cultivo y los requisitos para la modulación funcional de los linfocitos T.

El método sencillo proporcionó información sobre el tratamiento de enfermedades virales. También puede aplicarse a otros campos, como el cáncer.