Name: HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a expandir linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno usando células presentadoras artificiales basadas en HLA A2-Ig. Este método mejora la eficiencia de la inmunoterapia adoptiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría dar las gracias a Aaron Selya útil para el debate. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AI29575, CA108835, AI077097 a JS, una subvención piloto de la Johns Hopkins malaria Instituto de Investigación y el Departamento de Defensa de conceder PC 040972 para MO

1. Decisiones, HLA-A2-Ig base AAPC <ol><li> Prepare el buffer de borato estéril <ol><li> Disolver el ácido bórico en agua para 0,1 M. Ajustar el pH a 7.0. </li><li> Filtrar a través de un filtro de 0.22μm estéril y se almacenan a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare el buffer de lavado estéril bolas <ol><li> Tomar 956ml PBS w / o magnesio o calcio. </li><li> Añadir 30 ml de suero humano AB. </li><li> Añadir EDTA 2 mM de concentración final. </li><li> Añadir 0.1gsodium azida. </li><li> Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras estéril y se almacenan a 4 ° C. </li></ol></li><li> Tomar 1 ml de perlas de Invitrogen Epoxy M-450 en stock, aproximadamente 400 millones de cuentas (cuentas se pueden contar por hemocitómetro), y poner en un frasco estéril, tornillo de la tapa de cristal. </li><li> Ponga el frasco en contra de un imán Dynal MPC-1, mientras que las cuentas se adhieren a la pared del vial, separar el sobrenadante por aspiración. Lávese las cuentas de una vez con 1 ml de solución tampón de borato. </li><li> Volver a suspender las bolas en una mezcla de 1 ml de solución tampón de borato y 20 mg de HLA-A2-Ig dímero y 20 mg de CD28 mAb anti-humano (clon 9.3). </li><li> Proteína de la conjugación de bolas: poner el frasco de vidrio en los rotadores y girar a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Colocar el tubo en MPC-1 imán y eliminar todos los tampón borato. </li><li> Lave las cuentas dos veces con buffer de lavado de 1 ml de bolas. </li><li> Incubar las cuentas en un tampón de lavado 1 ml de bolas, gire a 4 ° C durante 24 horas. Debido a tampón de lavado bolas contiene suero humano AB, que bloqueará todos los sitios de unión a proteínas residuales en las cuentas. </li><li> Eliminar el sobrenadante del frasco de vidrio, sustituya con 1 ml de solución tampón fresca Lavar bolas. </li></ol> 2. Control de calidad de AAPC y el péptido de carga, almacenamiento <ol><li> Añadir ~ 5 × 10 5 gotas de tampón de lavado FACS 100μl en tubos de FACS, y se tiñen con 1μl de anti-ratón IgG1-PE (reconocer la porción Fc de HLA-A2-Ig) y 1μl de anti-ratón IgG2a-FITC (reconocer la parte Fc de mAb anti-CD28). Después de la tinción durante 20 minutos en FACS buffer de lavado, lavado de nuevo y leer el resultado de la tinción de inmediato por citómetro de flujo (Figura 4). </li><li> Carga de péptidos en las cuentas: lavar las cuentas dos veces en frasco de vidrio con 1 ml de PBS estéril. Resuspender con 1 ml de PBS estéril a continuación, agregar 10μl de CMV péptido (1mg/ml) </li><li> Contar las gotas de hemocitómetro, y la etiqueta del vial con la fecha y la concentración. </li><li> AAPC están listos para su uso después de por lo menos 3 días de incubación del péptido a 4 ° C, para permitir suficiente tiempo de unión del péptido en el dímero HLA-A2-Ig. Las cuentas se pueden almacenar a 4 ° C y seguir funcionando por lo menos durante 6 meses. </li></ol> 3. Aislamiento humano CTL <ol><li> Recoger ~ 100 ml de sangre periférica fresca de salud de los donantes HLA-A2 positivo en 10 tubos de sodio BD Vacutainer de heparina. Use una aguja de calibre 21 o mayor para evitar la hemólisis. </li><li> Centrifugar a 300xg durante 10 minutos a temperatura ambiente </li><li> Retire con cuidado la capa de plasma superior por aspiración. El plasma puede ser utilizado como suplemento para el medio de cultivo. </li><li> Vuelva a colocar el plasma recogido con PBS estéril y la transferencia de la sangre en un frasco de cultivo estéril T75 o 50 ml tubos cónicos. Mezclar la sangre con PBS y pipeteando arriba y hacia abajo. </li><li> Una vez que toda la sangre se recoge, prepara otros cuatro tubos cónicos de 50 ml y agregar 15 ml de Ficoll-Paque Plus. </li><li> Poco a poco superposición 30-35 ml de células de la sangre en la parte superior de la Ficoll de cada tubo. Mantener la interfaz entre los distintos Ficoll y las células sanguíneas. </li><li> Centrifugar a 500xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. A su vez el freno de "off" y la aceleración lo más bajo posible para mantener una relación clara entre las capas. </li><li> Con una pipeta seriological, cuidadosamente aspirar la capa de PBMC y recoger las PBMC en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Cuando todos los PBMC se cosechan agregar 30 ml de PBS y se giran a 400xg durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y lavar una vez más con 30 ml de PBS para eliminar todos los Ficoll residual. </li><li> Proceder a CD8 + aislamiento de células T mediante el uso de Miltenyi humana de células T CD8 + kit de aislamiento de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este kit muy enriquece de las células CD8 + (normalmente&gt; 95%) por el agotamiento de CD8 - las células. </li><li> Cuente los linfocitos T CD8 +. La pureza de la esperada debe ser mayor al 95%. Para confirmar este uso de 2x10 5 células y realizar un análisis CD4/3/8 FACS. El CTL restante puede ser utilizado de inmediato para el antígeno específico de la estimulación AAPC o pueden ser congelados para su uso futuro. </li></ol> 4. En el sistema de cultivo in vitro basado en AAPC <ol><li> Preparar medio de cultivo <ol><li> De TF (de células T del factor de crecimiento, realizado en el laboratorio 4) 2X medio de cultivo: medio RPMI completo, más el 5% de los donantes autólogos de plasma y un 8% el factor de células T de crecimiento. </li><liplasma donantes aut pueden ser sustituidos por inactivado calor suero humano ab.></liplasma></ol></li><li> Resuspender 1.000.000 CTL en 8 ml de medio TF cultura 2X más de 8 ml de medio RPMI completo, agregue 1 × 10 6 AAPC, mezclar bien. </li><li> Utilice una pipeta de canales múltiples de células de la placa en 96 y U fondo placas de cultivo de tejidos. (160 l por pocillo) </li><li> Las células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2 incubater durante 7 días. Alimentar a las células en el día 4 con 80 l / pocillo mediano TF 2X. </li><li> Las células están listas para ser cosechadas en el día 7. Después de la cosecha, el lugar a las células contra el imán y eliminar la AAPC de edad. </li><li> Antígeno específico puede ser determinado por tinción tetrámero de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tinción fenotipo y tinción intracelular de citoquinas se realizó de acuerdo a nuestros tres estudios anteriores. </li><li> Las células pueden ser cosechadas replated con AAPC de nuevo en las mismas condiciones. El número de células y la especificidad del antígeno se espera que aumente después de la estimulación repetida. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de AAPC después de la conjugación HLA A2-Ig y anti-CD28 se muestra en la Figura 4. Conjugación de proteínas con éxito es evidente un claro desplazamiento de la tinción de anticuerpos correspondientes. Mientras que la frecuencia de linfocitos T citotóxicos específicos de CMV en la sangre periférica es generalmente 0,5-1%, después de una semana de la AAPC mediada por la estimulación, la especificidad puede alcanzar el 55 - 93% (Figura 2 y 3). La expansión de CTL antígeno específico puede ser muy variable entre los diferentes donantes, pero los resultados son reproducibles dentro de un mismo donante. Por extrapolación, la expansión de las células específicas de CMV puede ser miles de veces en comparación con los niveles de precursor directamente ex vivo (datos no mostrados). Tinción intracelular de citoquinas (Figura 3) muestra que estos CTL ampliado son polifuncionales, más que agotado, después de cultivo celular y la proliferación prolongada significativa. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del Representante AAPC expansión ex vivo de la base CTL humanos para la inmunoterapia adoptiva en pacientes TCPH alogénicos <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante tetrámero de la tinción de linfocitos T citotóxicos específicos generados por CMV AAPC después de una semana de la cultura <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante resultado tinción intracelular de citoquinas de linfocitos T citotóxicos específicos generados por CMV AAPC (CMV especificidad fue del 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Representante de la tinción de la M-450 Epoxy cuentas después de la conjugación de proteínas teñidas con anti-ratón IgG1-PE y anti-ratón IgG2-FITC

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

El sistema de AAPC que describimos aquí es un sistema eficiente para la expansión ex vivo de linfocitos T citotóxicos humanos contra una variedad de antígenos. Especial cuidado se debe tomar con respecto a la calidad de la conjugación de la proteína y la distribución uniforme de la AAPC y CTL en el cultivo en placa de 96 pocillos. El uso de este enfoque que hemos sido capaces de ampliar CTL por más de 8 semanas, durante el cual hemos ampliado antígeno-específica CTL hasta un millón de veces 4. Ha habido varios sistemas de APC artificial utilizando líneas de células u otras plataformas acelular 5, sin embargo, de acuerdo con los datos publicados cada sistema tiene su perfil único en lo que respecta a la expansión y la especificidad de soporte de aplicaciones diferentes. Importante, ya que la calidad de CTL es tan importante como la cantidad, la polifuncionalidad de los CTL CMV específicos generados por nuestro sistema se espera que confieren superior anti-viral eficiencia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Vacutainer tubo (contiene heparina) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> Humana de células T CD8 + Kit de aislamiento </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 Epoxy </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 Imán </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig dímero X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetrámero (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon claro de 96 pocillos placa de Microtest </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Rata anti-ratón IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> Suero humano AB </td><td> Atlanta biológicos </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8a-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8a-APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano IFN-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Mouse anti-TNFa humano-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia ex vivo ampliación de los derechos humanos ctl

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL con función efectora óptima desempeñar un papel fundamental en la mediación de la protección contra diversas infecciones intracelulares y el cáncer. Sin embargo, los individuos pueden presentar microambiente inmunosupresores y, en contraste con la activación de CTL, sus células antígeno autólogo presenta tienden a tolerize o anergize CTL antígeno específico. Como resultado de ello, aunque todavía en fase experimental, CTL basado en inmunoterapia adoptiva ha evolucionado hasta convertirse en un prometedor tratamiento para diversas enfermedades como el cáncer y las infecciones de virus. En los experimentos iniciales ex vivo ampliado CMV (citomegalovirus) CTL específicas se han utilizado para el tratamiento de la infección por CMV en pacientes inmunocomprometidos trasplante alógeno de médula ósea. Si bien es común que amenaza la vida viremia por CMV en estos pacientes, ninguno de los pacientes que reciben ampliado CTL desarrollar enfermedades relacionadas con el CMV, lo que implica la inmunidad anti-CMV es establecido por la adoptively transferido CTL 1. Prometedores resultados también se han observado para el melanoma y puede extenderse a otros tipos de cáncer 2. Si bien hay muchas maneras de ex vivo de estimular y ampliar CTL humanos, los enfoques actuales están restringidas por las limitaciones técnicas y de costos. Por ejemplo, el estándar de oro actual se basa en el uso de la DC autólogas. Esto requiere que cada paciente para donar un número importante de los leucocitos y también es muy caro y laborioso. Por otra parte, se detalla en la caracterización in vitro de la DC amplió CTL ha revelado que estos tienen una función efectora sólo subóptima 3. Aquí presentamos un muy eficiente sistema de AAPC base para la expansión ex vivo de los derechos humanos CMV CTL específicas para inmunoterapia adoptiva (Figura 1). La AAPC se hicieron mediante el acoplamiento magnético de células cuentas de tamaño humano con HLA-A2-Ig anti-dímero y CD28mAb 4. Una vez que se hacen AAPC, que puede ser cargado con varios péptidos de interés, y seguir funcionando durante meses. En este informe, AAPC se cargaron con un péptido dominante de CMV, pp65 (NLVPMVATV). Después del cultivo humano purificado CD8 + CTL de un donante sano con AAPC por una semana, el CMV específica CTL se puede aumentar de manera espectacular en la especificidad de hasta el 98% (Figura 2) y se amplifica más de 10.000 veces. Si hay más CMV-CTL específicos se requiere, una mayor expansión se puede conseguir fácilmente por la estimulación repetitiva con AAPC. Caracterización fenotípica y funcional muestra que estas células se han ampliado el fenotipo de un efectoras de memoria y hacer que cantidades significativas de TNF-alfa y IFN (Figura 3).

Un nuevo método de CC independiente para la inducción y la expansión de células T específicas de antígeno se describe. HLA A2-Ig células antígeno artificial basada en la presentación (AAPC) se cargan con el HLA-A2 péptidos restringidos a expandirse de manera eficiente CTL del antígeno específico diverso. Esta tecnología tiene un gran potencial para el CTL basado inmunoterapia adoptiva.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) con una función efectora óptima desempeñan funciones críticas en la mediación de la protección contra diversas infecciones intracelulares y el cáncer. Sin embargo, los individuos...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células presentadoras de antígeno artificiales o una A PC para la expansión ex vivo de CTL humanos específicos para antígenos, con posible uso en inmunoterapia adoptiva. Esto se logra primero conjugando HLA A dos IG y anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano a microesferas magnéticas Dyna para crear una A PC. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar control de calidad y carga de péptidos en la A PC. El tercer paso del procedimiento es aislar células T CD8 positivas de sangre periférica humana. El paso final del procedimiento es incubar las células T CD8 positivas con una A PC durante una semana.Luego se cosechan los CTL y se caracterizan antes de ser utilizados o volver a estimularlos durante otra semana para alcanzar el nivel deseado de su especificidad y expansión. Finalmente, se pueden obtener resultados de tinción o de teum que muestran que los CTL expandidos en presencia de A A PC presentan una especificidad antigénica aumentada. Hoy voy a mostrarles un sistema A A PC basado en HI IG y cómo utilizar este sistema para expandir eficientemente CTL humanos específicos contra el CMV exvivo en comparación con otros métodos existentes.Nuestra tecnología A A PC ofrece varias ventajas importantes. Está disponible comercialmente, se dispone de ella en cantidad ilimitada y, digamos, A A PC puede utilizarse para todos los donantes HRAA dos positivos. Bien, comencemos: transfiera un mililitro de perlas de epoxi M cuatro 50 de un stock con aproximadamente 400 millones de perlas a un tubo de vidrio estéril con rosca.Lave las perlas una vez añadiendo un mililitro de tampón boid y luego colocando el vial de vidrio contra un imán NBC uno mientras las perlas se adhieren al costado del vial. Retire el sobrenadante por aspiración. Suspender las perlas en una mezcla de tampón boid, dímero HLA A2-Ig y anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano.Luego, para facilitar la conjugación de la proteína con las perlas, gire el vial de vidrio en un rotador a cuatro grados Celsius durante 24 horas. A continuación, coloque el tubo en un imán MPC uno y retire todo el tampón borato. Una vez eliminado el tampón, lave las perlas dos veces con un mililitro de tampón de lavado de perlas.Ahora incube las perlas en un mililitro de tampón de lavado de perlas y rote el vial a cuatro grados Celsius durante otras 24 horas para bloquear los sitios residuales de unión a proteínas en las perlas. Luego, retire el tampón del vial de vidrio y sustitúyalo con un mililitro de tampón de lavado de perlas fresco. Transfiera 100 microlitros de tampón de lavado de fax a tubos de fax y, a continuación, agregue cinco veces 10 a la quinta perlas.Coloree las perlas con un microlitro de IgG anti ratón PE y un microlitro de IgG anti ratón AFite después de colorear durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Añada tres mililitros de tampón de lavado FACS a cada una de las muestras de tinción. Luego, haga el pellet de las APC mediante centrifugación a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Suspenda los A A PC en tampón de fax fresco y lea inmediatamente el resultado de tinción mediante citometría de flujo. Lave las perlas dos veces con PBS estéril como antes. A continuación, cargue las perlas con 10 microlitros de péptido de CMV.Contar las perlas mediante hemocitómetro y luego etiquetarlas con la fecha y la concentración de las perlas, en perlas por mililitro. Incubar las APC con el péptido durante al menos tres días a cuatro grados Celsius. Centrifugar aproximadamente 100 mililitros de sangre periférica fresca de un donante positivo para HLA-A2 en tubos vacutainer con heparina sódica al 10 % a 300 ×g durante 10 minutos.A temperatura ambiente, retire cuidadosamente la capa superior de plasma mediante aspiración. Sustituya el plasma recolectado por PBS estéril y transfiera la sangre a un frasco de cultivo estéril T 75. Mezcle bien la sangre y el PBS mediante pipeteo una vez que toda la sangre haya sido recolectada en 15 mililitros del fial pack más cuatro tubos cónicos de 50 mililitros.Coloque lentamente 30 a 35 mililitros de las células sanguíneas encima del fial en cada tubo. Manteniendo la interfase bien definida entre el fial y las células sanguíneas, centrifugue el gradiente de sangre y fial a 500 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente, con el freno desactivado y la aceleración lo más baja posible para mantener una interfase clara entre las capas tras la centrifugación. Aspire cuidadosamente la capa superior de plasma y luego use una pipeta serológica para extraer con cuidado la capa de PBMC. Transfiera los PBMC a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Una vez que se hayan recolectado todos los PBMC, añada 30 mililitros de PBS a las células y centrifúguelas.A continuación, deseche el sobrenadante y lave el sedimento una vez más con 30 mililitros de PBS para eliminar el residuo de fi call, luego enriquezca la población de linfocitos T CD8 positivos utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8 positivos humanos Milton según el protocolo del fabricante. Cuente los linfocitos T CD8 positivos y confirme la pureza mediante análisis de fax.Suspenda 1 millón de CTL en ocho mililitros de medio de cultivo con factor de crecimiento para linfocitos T 2x más ocho mililitros de medio RPMI completo y agregue 1 × 10⁶ de la mezcla de APC. Luego, utilice una pipeta multicanal para sembrar 160 microlitros de células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U. Incube las células a 37 grados Celsius en un 5 % de dióxido de carbono durante siete días.Alimente las células el día cuatro con 80 microlitros por pocillo de medio de cultivo con factor de crecimiento para linfocitos T. Recolecte las células el día siete y luego coloque el tubo contra el imán para eliminar el A A PC viejo cuando todas las perlas se adhieran a la pared del vial.Recolecte y transfiera las células a otro tubo cónico de 50 mililitros y cuente el número de células. Determine la especificidad del antígeno de la A A PC mediante tinción con tetrámero según el protocolo del fabricante. Repita el cultivo de las células recolectadas con nuevas A A PC en las mismas condiciones para aumentar el número de células con especificidad para el antígeno.A continuación se muestra un resultado representativo de tinción con tetrámeros de CTL específicos contra CMV generados por A A PC tras una semana de cultivo. Se presenta aquí un resultado representativo de tinción de citocinas intracelulares de CTL específicos contra CMV generados por A-A-P-C. La especificidad contra CMV fue del 61 % según la tinción con tetrámeros. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de los linfocitos T, como por ejemplo cómo podemos identificar las condiciones óptimas de cultivo y los requisitos para la modulación funcional de los linfocitos T.El método sencillo proporcionó información sobre el tratamiento de enfermedades virales. También puede aplicarse a otros campos, como el cáncer.

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Directrices se presentan para la generación de antígeno artificial asesino células presentadoras, KaAPC, una herramienta eficaz para el agotamiento in vitro de células T específicas de antígeno humanos y una solución alternativa a la inmunoterapia celular para el tratamiento de la T enfermedades autoinmunes mediadas por células en un antígeno forma específica sin comprometer el sistema inmune restante.

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente In Vitro El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .

Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.

Uso de la única cadena MHC tecnología investigar Co-agonismo humano CD8 + activación de células T

En este artículo se describe un método para generar un método para generar un antígeno tumoral funcional específico de antígeno pluripotente derivado de células madreCD8- + células T positivas únicas utilizando el sistema de cocultivo OP9/DLL1.

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

Se presenta un protocolo para la expansión del producto farmacológico de células T Gamma-Delta (γδ). Los linfocitos se aíslan por elutriación y se enriquecen con γδ con ácido zoledrónico e interleucina-2. Las células T alfa-beta se agotan utilizando un dispositivo de separación magnética de grado clínico. Las células γδ se cocultivan con células artificiales presentadoras de antígenos derivadas de K562 y se expanden.

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Aprende a expandir linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno usando células presentadoras artificiales basadas en HLA A2-Ig. Este método mejora la eficiencia de la inmunoterapia adoptiva.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL (Video) | JoVE Journal

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

Explorar más videos