HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células presentadoras de antígenos artificiales o un PC A para la expansión ex vivo de CTL específico del antígeno humano para su uso potencial en inmunoterapia adoptiva. Esto se logra conjugando primero HLA A dos IG y anticuerpo monoclonal CD 28 humano a perlas de dina magnéticas para hacer que A A PC EE. El segundo paso del procedimiento es realizar el control de calidad y la carga peptídica del A A PC. El tercer paso del procedimiento es aislar células T positivas CD ocho de sangre periférica humana. El paso final del procedimiento es incubar células T CD ocho positivas con un PC A durante una semana.

A continuación, se cosechan y caracterizan los CTL antes de utilizarlos o se vuelven a estimular durante otra semana para alcanzar el nivel deseado de su especificidad y expansión. En última instancia, se pueden obtener resultados de teum o tinción que muestran que los CTL que se expanden en presencia de A A PC tienen una mayor especificidad antigénica. Hoy les mostraré un sistema de PC basado en HI IG y cómo usar este sistema para expandir de manera eficiente el CTL humano específico de CMV exvivo en comparación con otros métodos existentes.

Nuestra tecnología A A PC ofrece varias ventajas importantes. Está disponible en el estante, es de cantidad ilimitada y, digamos, una PC se puede usar para todos los donantes positivos de HRAA. Bien, comencemos Transfiera un mililitro de M cuatro cuentas de epoxi 50 de un stock de aproximadamente 400 millones de cuentas a un archivo de vidrio estéril.

Lave las perlas una vez agregando un mililitro de tampón boid y luego colocando el frasco de vidrio contra un dino de imanes NBC mientras las perlas se adhieren al costado del vial. Retire la mordaza por aspiración Resus. Suspenda las perlas en una mezcla de tampón bólido HLA A dos dímeros IG y anticuerpo monoclonal CD 28 humano.

Luego, para facilitar la conjugación de la proteína a las perlas, gire el frasco de vidrio en un rotador a cuatro grados centígrados durante 24 horas. A continuación, coloque el tubo en un imán MPC y retire todo el tampón de borato. Una vez que se haya eliminado el tampón, lave las perlas dos veces con un mililitro de tampón de lavado de perlas.

Ahora incube las perlas en un mililitro de tampón de lavado de perlas y gire el vial a cuatro grados centígrados durante otras 24 horas para bloquear los sitios de unión de proteínas residuales en las perlas. A continuación, retire el tampón del vial de vidrio y sustitúyalo por un mililitro de tampón de lavado de perlas frescas. Transfiera 100 microlitros de tampón de lavado de fax a los tubos de fax y luego agregue cinco veces 10 a la quinta perla.

Teñir las perlas con un microlitro de IgG anti musa, un PE y un microlitro de IgG anti musa dos veces después de teñir durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A tres mililitros de tampón de lavado fax a cada una de las muestras de tinción. A continuación, pegue el A A PC gastándolo a 300 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Reus suspende el A A PC en un tampón de fax nuevo y lee el resultado de la tinción inmediatamente mediante un citómetro de flujo. Lave las perlas dos veces con PBS estéril como antes. A continuación, cargue las perlas con 10 microlitros de péptido CMV.

Cuente las cuentas con hemocitómetro y luego etiquételas con la fecha y la concentración de las cuentas. Como cuentas por mililitro. Incubar el A A PC con el péptido durante al menos tres días a cuatro grados centígrados, centrifugar aproximadamente 100 mililitros de sangre periférica fresca de un donante HLA A dos positivos en 10 tubos de heparina sódica vacutainer a 300 Gs durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, retire con cuidado la capa superior de plasma por aspiración. Reemplace el plasma recolectado con PBS estéril y transfiera la sangre a un matraz de cultivo T 75 estéril. Mezcle bien la sangre y el PBS pipeteando una vez que se haya recogido toda la sangre en 15 mililitros de paquete de fial más cuatro tubos cónicos de 50 mililitros.

Superponga lentamente de 30 a 35 mililitros de células sanguíneas en la parte superior del fial en cada tubo. Manteniendo la interfaz distinta entre el fial y las células sanguíneas, centrifugar el gradiente sanguíneo y fial a 500 GS durante 20 minutos a temperatura ambiente, con la ruptura y la aceleración lo más baja posible para mantener una interfaz clara entre las capas después del espín, aspire la capa de plasma superior y luego use una pipeta serológica para aspirar cuidadosamente la capa de PBMC. Transfiera el PBMC a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros cuando todos los PBMC se hayan cosechado a 30 mililitros de PBS a las celdas y centrifuérrelas.

A continuación, deseche el supernat y lave el pellet. Una vez más con 30 mililitros de PBS para eliminar la llamada de fi residual, luego enriquezca para la población de células T CD ocho positivas utilizando un kit de aislamiento de células T positivas para CD ocho humano de Milton. De acuerdo con el protocolo del fabricante, cuente el CD ocho células T positivas y confirme la pureza mediante un análisis por fax.

Suspenda 1 millón de CTL en ocho mililitros de factor de crecimiento de células T, dos x medio de cultivo más ocho mililitros de medio RPMI completo y agregue una vez 10 de la mezcla de seis A a PC. A continuación, utilice una pipeta multicanal para colocar 160 microlitros de células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante siete días.

Alimente las células en el cuarto día con 80 microlitros por pocillo de crecimiento de células T. Factor dos x medio de cultivo. Coseche las células el día siete y luego coloque las células contra el imán para eliminar la vieja A A PC cuando todas las perlas se adhieran a la pared del vial.

Recoja y transfiera las células a otro tubo cónico de 50 mililitros y cuente el número de células. Determinar la especificidad antigénica del A A PC mediante tinción de tetrámeros de acuerdo con el protocolo del fabricante. Repita las células recolectadas con el nuevo A A PC en las mismas condiciones para generar un mayor número de células en la especificidad del antígeno.

A continuación se muestra un resultado representativo de la tinción de tetrámeros de CTL específico de CMV generado por A A PC después de una semana de cultivo. Aquí se muestra un resultado representativo de la tinción de citocinas intracelulares de CTL específico de CMV generado por A-A-P-C-C-M-V la especificidad fue del 61% por tinción de tetrámeros. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de las células T, como por ejemplo, cómo podemos identificar las condiciones culturales óptimas y los requisitos para la modulación funcional de las células T.

El método humilde proporcionó información sobre el tratamiento de enfermedades virales. También se puede aplicar en otros campos como el cáncer.