Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Método rentable para el seguimiento de fuentes microbianas utilizando virus humanos y animales específicos. El estudio describe un método rentable para la identificación de la fuente de contaminación de la orina fecal o por nitratos en el agua utilizando PCR cuantitativa para la cuantificación específica de porcino, bovino, virus de ADN, adenovirus y poliomavirus humanos propuestos como herramientas de seguimiento de fuentes microbianas. Hemos desarrollado un protocolo para la concentración de virus a partir de muestras de 10 litros de agua mediante floculación orgánica mediante leche desnatada, extracción de ácidos nucleicos virales del sedimento y cuantificación de virus DNI humanos bovinos o porcinos mediante PCR cuantitativa.

Es bien sabido que la contaminación microbiana de la vitamina representa un riesgo significativo para la salud y necesitamos conocer las fuentes de la contaminación. Hemos propuesto el uso de virus de ADN altamente prevalentes como herramientas de seguimiento de fuentes microbianas. Los virus seleccionados son adenovirus y poliomavirus.

Esos virus se excretan de forma persistente durante todo el año y en todas las zonas geográficas. Estudiado en estudios previos. Hemos desarrollado métodos robustos de concentración de virus de bajo coste en agua, y hemos estado trabajando en el desarrollo de ensayos de QPCR para la cuantificación de adenovirus de purinas y poliomavirus bovinos.

Además, utilizamos adenovirus humanos, Poliomavirus NGC, probados por QPCR, también como marcadores de contaminación humana en el agua, Recogida de muestras de agua. En este estudio se recogen cuatro réplicas de 10 litros por muestra de agua en recipientes de plástico con fondo plano y una muestra extra como control de proceso. Esta última muestra se sembrará con una cantidad conocida de las partículas virales utilizadas como control.

Un control negativo se prepara en el laboratorio utilizando agua del grifo en un recipiente de plástico adicional de 10 litros. Si la muestra presenta una gran cantidad de material en suspensión, arena y otros materiales, déjela sedimentar durante 15 minutos, transfiera el agua a un nuevo recipiente. Concentración viral por floculación orgánica.

La detección de virus en muestras de agua baja o moderadamente contaminada requiere la concentración de los virus de al menos varios litros de agua en un volumen mucho menor. El procedimiento de concentración incluye la acidificación de muestras de agua de 10 litros, la floculación utilizando leche desnatada por gravedad, la sedimentación de los lotes y la recolección del precipitado en 10 mililitros de tampón de fosfato para iniciar el proceso, se prepara una solución de localización de leche descremada en agua de mar artificial disolviendo 10 gramos de leche descremada en polvo en un litro de agua de mar artificial y ajustando cuidadosamente el pH a 3,5. Con ácido clorhídrico, el lote debe ser visible.

Prepare la solución justo antes de usarla o guárdela a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Las muestras de agua se agitan y se mide la conductividad de las muestras. Si está por debajo de 1,5 milisiemens, se agregarán sales marinas.

Ajuste el pH de la muestra de agua a 3,5 mediante la adición de ácido clorhídrico. Registre el pH de las muestras antes y después del acondicionamiento, así como el volumen de ácido clorhídrico utilizado. También se debe registrar la conductividad.

Después de ajustar el pH, añadimos 100 mililitros de leche descremada pref, 1% a la muestra de agua de 10 litros, y agitamos las muestras durante ocho a 10 horas para permitir que los virus se absorban en las parvadas. Para la muestra de espiga utilizada como control de proceso, agregue el volumen estándar del virus de control, un mililitro, por ejemplo, a la muestra. Detenga la agitación y deje que el lote se sedimente por gravedad durante ocho a 10 horas.

Pasadas las 16 horas, normalmente al día siguiente, podremos recoger los sedimentos. Para ello, elimine el sobrenadante con una bomba peristáltica. Recoja el sedimento con los lotes, aproximadamente 500 mililitros en una botella centrífuga.

Equilibrar las ollas mediante la adición de leche descremada pref flod pH 3.5, centrifugar las ollas con centrífuga de alta velocidad, 8, 000 Gs 30 minutos a cuatro grados centígrados. Tan pronto como la centrífuga se detenga, retire las ollas de centrífuga con cuidado de la centrífuga. Vierta muy suavemente y deseche el sobrenadante.

Disolver el pellet en cada botella de centrífuga hasta un volumen final de 10 mililitros de fosfato, extracción de ácido nucleico y cuantificación de virus. El concentrado viral se utiliza para la extracción de ácidos nucleicos virales y los adenovirus específicos y poliomas de interés se cuantificarán mediante A-Q-P-C-R. Realice una extracción de ácido nucleico con el mini kit de ARN viral de amplificador clave.

La lisis de los virus presentes en 140. Los microlitros de concentrados virales se realizan manualmente y los ácidos nucleicos totales se extraen a 80 microlitros. Este kit permite el uso de una plataforma automatizada como Key cube.

El siguiente paso es la cuantificación del genoma viral. Las copias de las muestras mediante el uso de una PCR cuantitativa con sondas tac-man, adenovirus humanos, virus del polioma JC y virus del polioma bovino se pueden cuantificar en la misma placa de 96 pocillos. Dado que todos utilizan los mismos ciclos de amplificación, los adenovirus porcinos deben analizarse por separado en una placa independiente para la cuantificación del virus objetivo.

Prepare la mezcla cuantitativa de PCR en un área limpia y separada. Una vez que se haya preparado la mezcla, asigne 15 microlitros en cada pocillo, incluidos los controles. Agregue las extracciones de ácido nucleico de las muestras 10 microlitros en un área separada, ejecute directamente y una dilución diez veces en agua purificada de cada muestra por duplicado, el volumen total para una reacción después de la adición del objetivo será de 25 microlitros, 15 de mezcla más 10 de muestra o cubra los pocillos que contienen las muestras con parte de una cubierta adhesiva.

Guarde la otra parte de la cubierta para el siguiente paso. Dilución AB de las suspensiones estándar de ADN. 10 microlitros de 10 a cero a 10 a seis copias del genoma, microlitros ficticios por triplicado y utilizando un micro pbit utilizado exclusivamente para la cubierta estándar de ADN.

Los pocillos que contienen los estandartes con la tapa adhesiva previamente cortada. Esta figura muestra la distribución de las muestras y controles de suspensión estándar. En la placa de 96 pocillos.

Realice la QPCR en un sistema adecuado, seleccionando los parámetros apropiados después de la activación de la amplitud de oro durante 10 minutos. A 95 grados centígrados, se realizan 40 ciclos de amplificación una vez que se completan las reacciones. Almacene los datos y los resultados como se describe en el manual del usuario del equipo utilizado.

La cantidad de ADN se definirá como la mediana de los datos obtenidos después de corregir el factor de dilución cuando sea necesario. El gráfico de amplificación y la curva estándar obtenidos para la cuantificación de adenovirus porcinos mostraron un coeficiente de correlación de 0,999. Los valores aceptables de pendiente oscilan entre menos 3,1 y menos 3,6 siguiendo el procedimiento.

Los virus humanos y animales descritos se han analizado en muestras de agua subterránea de una zona que presenta altos niveles de nitratos para definir las fuentes de contaminación. Las cuatro réplicas analizadas mostraron resultados positivos para el valor medio de los adenovirus porcinos, 7,74 por 10 a dos copias genómicas por litro, lo que estaría relacionado con la presencia de purines porcinos en el área circundante al sitio de muestreo, y demostraría la presencia de contaminación fecal porcina en las aguas subterráneas. No hubo contaminación humana en ninguna de las muestras analizadas.

Los datos virológicos se confirmaron mediante PCR anidada y análisis de secuenciación. Conclusión. En este estudio, hemos presentado resultados analizando muestras de agua subterránea, presentando contaminación de origen porcino en ausencia de contaminación humana o bovina. El procedimiento también se ha aplicado al análisis de aguas de baño, agua de mar y agua de río.

Se presenta aquí el procedimiento para la aplicación de estas herramientas a la identificación de la fuente de contaminación en las aguas subterráneas, presentando altos niveles de nitrato como ejemplo de la aplicabilidad de los métodos desarrollados para detectar la fuente de contaminación en el medio ambiente.