Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Método rentable para el rastreo de fuentes microbianas mediante virus específicos de humanos y animales. El estudio describe un método rentable para la identificación del origen de la contaminación fecal, urinaria o por nitratos en el agua, utilizando PCR cuantitativa para la cuantificación específica de virus de ADN porcinos, bovinos y humanos, adenovirus y poliomavirus propuestos como herramientas para el rastreo de fuentes microbianas. Hemos desarrollado un protocolo para la concentración de virus a partir de muestras de agua de 10 litros mediante floculación orgánica, extracción de ácidos nucleicos virales del sedimento utilizando leche descremada y cuantificación de virus de ADN humanos, bovinos o porcinos mediante PCR cuantitativa.

Es bien sabido que la contaminación microbiana de la vitamina representa un riesgo sanitario significativo y necesitamos conocer las fuentes de dicha contaminación. Hemos propuesto el uso de virus de ADN altamente prevalentes como herramientas para el rastreo de fuentes microbianas. Los virus seleccionados son adenovirus y poliomavirus.

Esos virus se excretan de forma persistente durante todo el año y en todas las áreas geográficas. Estudiados en investigaciones previas. Hemos desarrollado métodos robustos y de bajo costo para la concentración de virus en el agua, y hemos estado trabajando en el desarrollo de ensayos de QPCR para la cuantificación de adenovirus de origen porcino y poliomavirus bovino.

Además, utilizamos adenovirus humanos y poliomavirus NGC, analizados mediante QPCR, también como marcadores de contaminación humana en el agua, recolección de muestras de agua. En este estudio, se recolectan cuatro réplicas de 10 litros por muestra de agua en recipientes de plástico con fondo plano y una muestra adicional como control del proceso. Esta última muestra se inoculará con una cantidad conocida de partículas virales utilizadas como control.

Se prepara un control negativo en el laboratorio utilizando agua de grifo en condiciones normales en un recipiente plástico adicional de 10 litros. Si la muestra presenta una gran cantidad de material en suspensión, arena y otros materiales, déjela sedimentar durante 15 minutos y luego transfiera el agua a un recipiente nuevo. Concentración viral mediante floculación orgánica.

La detección de virus en muestras de agua con baja o moderada contaminación requiere la concentración de los virus a partir de al menos varios litros de agua en un volumen mucho más pequeño. El procedimiento de concentración incluye la acidificación de muestras de agua de 10 litros, la floculación utilizando leche descremada por gravedad, la sedimentación de los flóculos y la recolección del precipitado en 10 mililitros de tampón fosfato para iniciar el proceso. Una solución para obtener leche descremada en agua de mar artificial se prepara disolviendo 10 gramos de polvo de leche descremada en un litro de agua de mar artificial y ajustando cuidadosamente el pH a 3,5 con ácido clorhídrico. Los flóculos deben ser visibles.

Prepare la solución justo antes de su uso o almacénela a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Se agitan las muestras de agua y se mide la conductividad en las muestras. Si es inferior a 1,5 milisiemens, se añadirán sales marinas.

Ajuste el pH de la muestra de agua a 3,5 mediante la adición de ácido clorhídrico. Registre el pH de las muestras antes y después del acondicionamiento, así como el volumen de ácido clorhídrico utilizado. También se debe registrar la conductividad.

Después de ajustar el pH, agregamos 100 mililitros de leche descremada pref flod, al 1 %, a la muestra de agua de 10 litros, y agitamos las muestras durante ocho a 10 horas para permitir que los virus se adsorban a los flóculos. Para la muestra con adición de estándar utilizada como control de proceso, agregue el volumen estándar del virus de control, un mililitro, por ejemplo, a la muestra. Detenga la agitación y deje que los flóculos sedimenten por gravedad durante ocho a 10 horas.

Después de 16 horas, comúnmente al día siguiente, podremos recolectar los sedimentos. Para ello, retire el sobrenadante utilizando una bomba peristáltica. Recoja el sedimento junto con los flocs, aproximadamente 500 mililitros, en un frasco para centrífuga.

Equilibre los recipientes mediante la adición de leche descremada tamponada a pH 3,5, centrifugue los recipientes en una centrífuga de alta velocidad a 8.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Tan pronto como la centrífuga se detenga, retire cuidadosamente los recipientes de la centrífuga. Vierta y deseche con mucho cuidado el sobrenadante.

Disuelva el precipitado en cada frasco de centrífuga hasta un volumen final de 10 mililitros de fosfato, extracción de ácidos nucleicos y cuantificación de virus. El concentrado viral se utiliza para la extracción de ácidos nucleicos virales y los adenovirus y poliomavirus específicos de interés se cuantificarán mediante A-Q-P-C-R. Realice una extracción de ácidos nucleicos con el kit mini de RNA viral KeyAmp.

La lisis de los virus presentes en 140 microlitros de concentrados virales se realiza manualmente, y los ácidos nucleicos totales se extraen en un volumen de 80 microlitros. Este kit permite el uso de una plataforma automatizada como Key cube.

El siguiente paso es la cuantificación del genoma viral. Se pueden cuantificar copias en las muestras mediante una PCR cuantitativa con sondas TaqMan; los adenovirus humanos, los virus JC poliomavirus y los virus poliomavirus bovinos pueden cuantificarse en la misma placa de 96 pocillos. Dado que todos utilizan los mismos ciclos de amplificación, los adenovirus porcinos deben analizarse por separado en una placa independiente para la cuantificación del virus diana.

Preparar la mezcla de PCR cuantitativa en un área separada y limpia. Una vez preparada la mezcla, distribuir 15 microlitros en cada pocillo, incluyendo los controles. Añadir las extracciones de ácidos nucleicos de las muestras, 10 microlitros en un área separada, directamente y una dilución diez veces en agua purificada de cada muestra por duplicado; el volumen total para una reacción tras la adición del objetivo será de 25 microlitros, 15 de mezcla más 10 de muestra o estándar. Cubrir los pocillos que contienen las muestras con una parte de una cubierta adhesiva.

Guarde la otra parte de la cubierta para el siguiente paso. Dilución AB de las suspensiones patrón de ADN. Tome 10 microlitros desde 10 a cero hasta 10 a seis copias genómicas, dispense microlitros por triplicado y utilice un micropipeta exclusivamente dedicada para la cubierta de ADN patrón.

Los pocillos que contienen los estándares con la cubierta adhesiva previamente cortada. Esta figura muestra la distribución de las muestras de suspensión de estándares y los controles. En la placa de 96 pocillos.

Realice la PCR cuantitativa en un sistema adecuado, seleccionando los parámetros apropiados tras la activación del oro de amplitud durante 10 minutos. A 95 grados Celsius, se realizan 40 ciclos de amplificación una vez completadas las reacciones. Almacene los datos y resultados según se describe en el manual del usuario del equipo utilizado.

La cantidad de ADN se definirá como la mediana de los datos obtenidos tras corregir el factor de dilución cuando sea necesario. La gráfica de amplificación y la curva estándar obtenidas para la cuantificación de adenovirus porcinos mostraron un coeficiente de correlación de 0,999. Los valores aceptables de pendiente oscilan entre -3,1 y -3,6 siguiendo el procedimiento.

Se han analizado virus humanos y animales descritos en muestras de agua subterránea de una zona con altos niveles de nitratos para determinar los orígenes de la contaminación. Las cuatro réplicas analizadas dieron resultados positivos para adenovirus porcinos (valor medio: 7,74 × 10² copias genómicas por litro), lo que estaría relacionado con la presencia de purines porcinos en la zona circundante al punto de muestreo y demostraría la existencia de contaminación fecal porcina en el agua subterránea. No se detectó contaminación humana en ninguna de las muestras analizadas.

Los datos virológicos se confirmaron mediante análisis de PCR anidada y secuenciación. Conclusión. En este estudio, hemos presentado resultados que analizan muestras de agua subterránea, mostrando contaminación de origen porcino en ausencia de contaminación humana o bovina. El procedimiento también se ha aplicado al análisis de aguas de baño, agua de mar y agua de río.

Presentamos aquí el procedimiento para aplicar estas herramientas a la identificación de la fuente de contaminación en aguas subterráneas, utilizando niveles elevados de nitrato como ejemplo de la aplicabilidad de los métodos desarrollados para detectar la fuente de contaminación en el medio ambiente.