Sistema de detección de virus de ADN basado en RPA-CRISPR/Cas12A-SPM y Deep Learning
10 de mayo de 2024
Presentamos un protocolo que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa con un sistema CRISPR/Cas12a para la detección de trazas de virus de ADN y construye una microscopía portátil para teléfonos inteligentes con una clasificación asistida por inteligencia artificial para la detección de virus de ADN en el punto de atención.
Nuestro protocolo introduce un sistema de detección rápido y altamente sensible para el virus de la rana 3. Cabe destacar que este método permite la detección de virus de ADN en el punto de atención, lo que desempeña un papel crucial en la prevención de la aparición de enfermedades pandémicas. La principal ventaja de esta técnica radica en su integración de RPA con el sistema CRISPR/Cas12a, complementado con un microscopio portátil basado en un teléfono inteligente y clasificación de IA.
Esta integración mejora significativamente la eficiencia y la precisión de la detección, al tiempo que reduce los errores atribuidos a factores humanos. Para comenzar, agregue las cuatro enzimas RPA clave en el tampón de reacción. A continuación, añada los cebadores prediseñados a la mezcla.
Agita la mezcla a fondo. Agregue un microlitro del ADN objetivo obtenido del virus de la rana 3 a cada reacción de RPA y vórtice para mezclar bien. A continuación, pipetee siete microlitros de cloruro de magnesio de 100 milimolares para iniciar la reacción.
Incube la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos para completar el ensayo. Prepare la proteína CAS12a de la bacteria Lachnospiraceae con ARN CRISPR para formar complejos funcionales. Mezcle la proteína bacteriana y 10 tampones de reacción CRISPR/Cas12a.
Ahora agregue 500 sondas reporteras de ADN monocatenario de 500 nanomolares. Agregue un microlitro de producto de reacción RPA a la mezcla de reacción de ARN CRISPR/Cas12a CRISPR. Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Mida las señales fluorescentes con un lector de microplacas. Para la detección con un microscopio de teléfono inteligente, primero pipetee la mezcla de reacción preparada en un portaobjetos de vidrio retraído. Luego cúbralo con un cubreobjetos antes de la incubación.
Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio del teléfono inteligente y ajuste la distancia focal y la claridad. Captura una imagen para medir las señales fluorescentes. Utilice ImageJ para medir el valor medio de gris de cada imagen y la desviación estándar del valor medio de gris en un grupo de concentración.
Adopte el modelo de aprendizaje profundo AlexNet 33 para la clasificación. Ahora use Python para cambiar la forma de las imágenes de entrada a 224 por 224 por tres canales. Por último, utilice una red troncal previamente entrenada con un conjunto de datos ImageNet para extraer características de imagen.
El sexto par de cebadores proporcionó la máxima eficiencia de amplificación y se seleccionó. El ARN-3 de CRISPR demostró ser el más eficiente para la escisión colateral. El uso de un sistema de detección desarrollado con cebadores RPA seleccionados y ARN CRISPR dio lugar a diferencias significativas entre 10 aM FV3 y el control.
El punto más importante que hay que recordar es el paso específico de detección de CAS 12a. El ARN CRISPR de la reacción puede modificarse o rediseñarse para dirigirse a otros virus de ADN en función de la detección de CAS 12a. El método propuesto puede ayudar en la evaluación preliminar de la cantidad del virus objetivo.
En base a esto, se pueden emplear otros métodos como la qPCR para obtener una carga viral más precisa. Esta técnica proporciona un intento preliminar hacia la detección portátil de virus de ADN. En cuanto al virus de la rana 3 utilizado en este protocolo, la detección oportuna puede dar lugar a medidas de protección efectivas, reduciendo las pérdidas en la industria de la cría.
Descripción general
Este estudio presenta un sistema de detección rápido y sensible para el virus de la rana 3, destacando la integración de la amplificación isotérmica mediada por recombinasa (RPA) con el sistema CRISPR/Cas12a para permitir la detección de virus de ADN en el punto de atención. Este método innovador tiene como objetivo mejorar la precisión y eficiencia en la detección, lo cual es crucial para prevenir posibles brotes pandémicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología molecular
- Detección de patógenos
- Diagnóstico en el punto de atención
Antecedentes
- La importancia de la detección rápida de virus en la prevención de pandemias.
- La integración de metodologías avanzadas como la amplificación isotérmica mediada por enzimas recombinasas (RPA) y la tecnología CRISPR.
- El papel de los sistemas portátiles en evaluaciones diagnósticas listas para su uso en campo.
Métodos Utilizados
- Amplificación isotérmica mediada por recombinasa (RPA)
- Sistema CRISPR/Cas12a
- Microscopía basada en teléfono inteligente con clasificación asistida por inteligencia artificial
Resultados principales
- Diferenciación significativa entre muestras de FV3 de 10 aM y muestras de control.
- Detección mejorada de la precisión mediante el uso de cebadores específicos y ARN CRISPR.
- Potencial para adaptar el método a otros virus de ADN modificando el ARN CRISPR.
Conclusiones
- El estudio demuestra un método eficiente y portátil para la detección de virus de ADN.
- Este enfoque es relevante para medidas protectoras oportunas en la industria de cría, lo que ilustra su importancia en la investigación biológica y la salud pública.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas rápidos y portátiles de detección de virus de ADN son fundamentales para la intervención temprana y el control tanto en entornos de investigación como en aplicaciones biofarmacéuticas. La integración de RPA-CRISPR/Cas12a con microscopía basada en teléfonos inteligentes y aprendizaje profundo permite la detección sensible y específica por secuencia en el punto de atención, reduciendo la dependencia de laboratorios centralizados. Este enfoque facilita la toma acelerada de decisiones y la mitigación de riesgos en las fases de descubrimiento y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación rápida de dianas de ADN viral para la reducción de riesgos mecanicistas.
- Apoya la validación funcional de reactivos de detección y ARN guías CRISPR.
- Facilita la triage temprana de sistemas de detección candidatos para el avance de la cartera.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una lectura estandarizada y cuantitativa para la optimización y validación del ensayo.
- Permite flujos de trabajo de detección reproducibles y escalables, adecuados para cribado de alto rendimiento.
- Facilita la comparación robusta de la eficiencia de los cebadores y del ARN CRISPR para el perfeccionamiento del ensayo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con las estrategias de biomarcadores traslacionales al permitir la detección viral en campo.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante resultados portátiles y cuantitativos.
- Reduce el riesgo biológico al permitir la detección y la intervención oportunas en modelos relevantes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este sistema conecta el descubrimiento inicial, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional al proporcionar una plataforma portátil de detección cuantitativa adaptable a múltiples virus de ADN.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la validación de dianas mediante la detección específica de secuencias.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos de fluorescencia reproducibles para la estandarización de ensayos.
- Análisis: Integra clasificación basada en aprendizaje profundo para una interpretación objetiva de los resultados con alta confianza.
- Investigación Traducional: Permite una detección rápida y lista para su uso en campo, apoyando estudios preclínicos y de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma modular adaptable a nuevos objetivos virales mediante el rediseño de guías de ARN CRISPR.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la detección viral.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los flujos de trabajo de detección.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance rápido de las tecnologías de detección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular y diseño de ensayos CRISPR.
- Necesita acceso a dispositivos de imagen portátiles e infraestructura computacional para análisis con inteligencia artificial.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de ensayo y la interpretación de datos.
- Adaptable a diversos virus de ADN mediante la modificación de las secuencias de ARN CRISPR.
- Depende de una validación previa antes de su implementación en diversos entornos de campo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
