Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar, purificar y caracterizar complejos que contienen lantánidos que se pueden utilizar para marcar macromoléculas biológicas. Esto se logra mezclando primero el metal de partida, el material de partida y el ligando, mientras se controla el pH de la solución. El segundo paso del procedimiento es purificar el complejo resultante mediante diálisis.

A continuación, se debe verificar la ausencia de metal libre. El paso final del procedimiento es la caracterización de las propiedades del complejo que son relevantes para la obtención de imágenes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que los complejos sintetizados se comportarán como agentes de contraste a través de mediciones de la actividad de relajación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la imagen, como si el número de coordinación del agua de un agente de contraste cambia al unirse a una proteína. En general, las personas que necesitan este método tendrán dificultades porque el control cuidadoso del pH dará como resultado que el LI sea inútil para la bioeducación. La demostración de las mediciones de diálisis y actividad estará a cargo de Buda y Sashi.

Estudiantes graduados de mi laboratorio: Para comenzar la metificación usando sales de lantánidos, primero disuelva un equivalente de ligando en agua para producir una solución de 30 a 265 milimolares. El ligando Paraiso Benzyl DTPA se utiliza aquí en una concentración de 73 Millimolar. A continuación, ajuste el pH de la solución del ligando entre 5,5 y siete añadiendo un hidróxido de amonio molar.

En este video, se utilizan 0,2 mililitros de la solución de hidróxido de amonio de un molar para disolver uno o dos equivalentes de cloruro de lantánido en agua para producir una solución con una concentración de cinco a 1000 milimolares. El cloruro de eurobio o el cloruro de gadolinio se pueden utilizar en concentraciones de 111 milimolares. A menudo se utiliza un exceso de metal para completar la ventilación y, en consecuencia, simplificar la purificación.

A continuación, agregue cada solución de sales de latán a la solución preparada de ligando mientras revuelve. Ahora ajuste el pH de las mezclas de reacción resultantes a entre 5,5 y siete añadiendo hidróxido de amonio 0,2 molar. En este caso, se utilizan un total de 0,5 mililitros de la solución de hidróxido de amonio 0,2 molar para ajustar la solución.

Si el ligando que se está utilizando contiene grupos funcionales sensibles a los ácidos, ajuste el pH varias veces durante este paso. Asegúrese de tener cuidado al ajustar el pH porque si la solución se vuelve demasiado básica, cualquier grupo funcional sensible a la base como el isotiocianato quedará inutilizable. Para la conjugación, controle de cerca la reacción a través de mediciones de pH.

La reacción se completa cuando el pH permanece constante En el caso de los ligandos sin ningún grupo funcional sensible a la base, también puede ser útil un estudio que implique elevar el pH. Para comenzar el análisis de diálisis, determine una longitud adecuada del tubo de diálisis para contener el volumen de la muestra más una longitud adicional para contener un 10% adicional del volumen de la muestra. A continuación, siga las instrucciones del fabricante para cortar el tubo a esta longitud.

En este video, se utilizó una membrana de corte de peso molecular de 100 a 500 Dalton, pero se puede usar un tubo de corte de peso molecular más grande según corresponda si la conjugación se realiza antes de la metificación, si corresponde, según las pautas del fabricante, remoje el tubo de diálisis cortado y riegue durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, llene un depósito de diálisis con agua, que servirá como dializado. Aquí se utiliza un vaso de precipitados de un litro.

El volumen de dializado debe ser aproximadamente 100 veces mayor que el de la muestra. Ahora doble un extremo del tubo dos veces y asegure la parte doblada con la pinza de cierre de diálisis. Envuelva el extremo del cierre con una banda elástica para asegurarse de que permanezca cerrado durante la diálisis.

Filtre la mezcla de reacción previamente preparada a través de un filtro de 0,2 micras. A continuación, cargue el filtrado en el extremo abierto del tubo. Tenga cuidado de no rasgar el tubo.

Asegúrese de dejar suficiente espacio para la cabeza para cerrar el tubo. Dobla el extremo abierto restante del tubo dos veces, luego asegúralo con un cierre y envuelve el cierre con una banda elástica. A continuación, conecte un vial de vidrio que contenga aire a la pinza en un extremo del tubo de diálisis con otra banda elástica.

A continuación, coloque un vial que contenga arena en la otra abrazadera. Estos viales garantizan que el tubo permanezca sumergido en el dializado. Ahora, coloque el tubo completo en el depósito de diálisis que contiene el dializado.

Agite el líquido de diálisis con una placa de agitación magnética a baja velocidad a temperatura ambiente. Asegúrese de que la velocidad de agitación permanezca lenta y la solución no. Vórtice. Cambie el dialato tres veces en el transcurso de un día.

En este vídeo, el dialato se cambia a las 2,5, 6,5 y 11,5 horas. Permita que la diálisis continúe durante la noche durante un total de 20 a 28 horas. Una vez finalizada la diálisis, retire el tubo del dialato y abra con cuidado un cierre para extraer la muestra.

Lave el tubo de diálisis tres veces con agua y combine los lavados con la muestra. Finalmente, retire el agua de la muestra a presión reducida aquí. Esto se logra mediante liofilización.

La muestra se congela y luego se coloca en un aparato de liofilización. Para evaluar la presencia de metal libre en la muestra, primero prepare el tampón de acetato disolviendo 1,4 mililitros de ácido acético en 400 mililitros de agua, y ajuste el pH a 5,8 con un hidróxido de amonio molar, y agregue agua para producir un volumen total de 500 mililitros. A continuación, disuelva 0,3 miligramos de cada complejo en 0,3 mililitros de tampón.

Ahora prepare el indicador de naranja xol, que debe ser de 16 micromolares en el tampón de pH 5.8. Añadir tres mililitros de esta solución indicadora a los complejos metálicos previamente disueltos. Detecte la presencia de metal libre mediante la observación de un cambio de color del indicador de amarillo a violeta.

Si se desea, la cantidad de metal libre se puede cuantificar creando una curva de calibración. Si queda metal libre, la muestra debe purificarse aún más mediante diálisis o cromatografía líquida de alta resolución antes de la caracterización. A continuación, para determinar el número de coordinación de agua para una muestra de opio, prepare una solución de aproximadamente un milimolar del complejo que contiene opio en agua, y luego otra solución de la misma concentración en óxido de deuterio.

Antes del análisis, la solución de óxido de deuterio debe evaporarse y disolverse en óxido de deuterio tres veces para eliminar el agua residual, encender el espectrofluorímetro, agregar la solución de agua a un veta limpia y colocar la veta en el espectrofluorímetro. Ahora realice la excitación y las emisiones para determinar los máximos de cada uno en aproximadamente 395 nanómetros, 595 nanómetros respectivamente. A continuación, realice un experimento de decaimiento en tiempo de fosforescencia utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión que se acaban de determinar y los parámetros que se muestran aquí.

Repita este paso con una solución de óxido de deuterio preparada a partir de los datos de desintegración de luminiscencia recién obtenidos en el gráfico, el registro natural de la intensidad frente al tiempo. La pendiente de estas líneas son las tasas de decaimiento. En este vídeo, se utilizó Microsoft Excel 2007 para generar los gráficos de registro natural a partir de los datos sin procesar.

Usa las tasas de decaimiento en la ecuación desarrollada por hors y compañeros de trabajo que se ven aquí. Si su ligando contiene grupos OH o NH coordinados con el metal, entonces la ecuación debe modificarse antes de su uso. Para determinar primero las mediciones de la relatividad de la muestra, seleccione el modo de aplicación deseado en el analizador de tiempo de relajación, ya sea T uno o T dos.

Aquí, se selecciona la configuración T one. A continuación, prepare una serie de muestras que contengan diferentes concentraciones del complejo que contiene lantánidos en un disolvente de aquiescencia. Aquí, el agua se utiliza como disolvente y las soluciones de diez, cinco, dos, 0,5, 1,25, 0,625 y cero.

Se preparan milimolares. Se pueden utilizar otros disolventes o tampones de tolerancia, pero es importante utilizar el disolvente como pieza en bruto. El volumen final de la muestra es específico del instrumento que se está utilizando.

Coloque una muestra en el instrumento y déjela reposar durante cinco minutos para que se equilibre con la temperatura del instrumento, que es de 37 grados centígrados para la unidad utilizada en este video. Ahora determine el tiempo de relajación en unidades de segundos ajustando los parámetros del software para obtener una curva exponencial suave para T uno o T dos. Repita esto para todas las muestras, incluida la pieza en bruto.

Ahora, calcule el inverso de los valores de relajación medidos T uno o T dos y grafique. Estos valores frente a la concentración de Lathan y las unidades de milimolar se ajustan a la gráfica con una línea recta. La pendiente de la línea ajustada es la actividad de relajación siendo R uno o R dos para T uno y T dos respectivamente.

Aquí vemos el esquema general para la mediación y la purificación. Este esquema describe el procedimiento general para la metificación y las razones para elegir diferentes raíces de purificación. Aquí vemos un gráfico representativo de desintegración de luminiscencia en el que se traza el registro natural de la desintegración en función del tiempo: las pendientes de las líneas generadas a partir de curvas similares requeridas para soluciones de agua y óxido de deuterio se utilizan con la ecuación uno para determinar el número de coordinación de agua de los complejos que contienen opio.

Un ejemplo representativo de mediciones de livity se puede ver aquí con una pendiente de la línea ajustada que es la livity T one de la muestra. Además del número de coordinación del agua y la caracterización de la lividad descritos en el protocolo, también es importante caracterizar los productos finales utilizando técnicas químicas estándar. La identidad del compuesto se puede obtener mediante espectrometría de masas, aquí se muestran espectros de masas representativos que muestran los patrones de isótopos de diagnóstico para los complejos que contienen gadolinio y opio.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectroscopia endr, la HPLC y el análisis elemental para caracterizar aún más los complejos resultantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar, purificar y caracterizar complejos que contienen lantánidos que se pueden usar para marcar macromoléculas biológicas.