Ensayo de cuantificación de infecciones bacterianas: un método para cuantificar la carga bacteriana intraocular en un modelo murino de endoftalmitis bacteriana

La endoftalmitis bacteriana es una dolencia ocular inflamatoria que ocurre cuando el Bacillus cereus, una bacteria patógena, infecta la región intraocular.

Para cuantificar la infección bacteriana, coloque un modelo de ratón sacrificado de endoftalmitis bacteriana lateralmente en una mesa de operaciones. Aplique una presión suave debajo del ojo para ayudar a separar el globo ocular de la cuenca. Transfiera el globo ocular a un tubo que contenga un tampón apropiado complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa.

Homogeneizar el tejido ocular para desintegrarlo, liberando bacterias en la suspensión. Los inhibidores de la proteasa presentes en el tampón inactivan las proteasas celulares liberadas para mantener la viabilidad bacteriana. A continuación, diluya en serie la suspensión bacteriana para obtener varias concentraciones de Bacillus cereus.

Tome una placa de cultivo en ángulo que contenga el medio de agar enriquecido y delimite las filas correspondientes a cada concentración de dilución. Dispense unas gotas de la suspensión bacteriana en la parte superior de la fila designada y deje que fluya hacia abajo hasta que llegue al final de la placa, ayudando a la propagación uniforme de bacterias. Aplana el plato e incuba.

Durante la incubación, cada bacteria utiliza los nutrientes del agar para proliferar y formar colonias individuales. El número de colonias disminuye, lo que corresponde a un aumento en la dilución de la suspensión bacteriana. Cuente el número de colonias en una fila en particular para cuantificar la carga bacteriana ocular.

En el punto final experimental apropiado, agregue 400 microlitros de PBS suplementado con inhibidor de proteasa en un tubo de cosecha esterilizado en autoclave marcado por ojo en hielo, y coloque fórceps abiertos de punta fina a cada lado del ojo infectado. Empuje las puntas hacia abajo hacia la cabeza para apuntalar el ojo.

Una vez que las pinzas estén detrás del globo ocular, aprieta las pinzas y retira las pinzas de la cabeza para separar el globo ocular. Luego, coloque inmediatamente el globo ocular en el tubo de recolección debidamente etiquetado. Dentro de los 60 minutos posteriores a la recolección de la muestra, coloque los tubos de recolección cerrados en un homogeneizador de tejidos y homogeneice las muestras durante dos períodos de homogeneización de un minuto, con un período de descanso de 30 segundos en el medio.

Después de la homogeneización, coloque las muestras en hielo y use alícuotas de homogeneizado de 20 microlitros para diluir en serie las muestras en 180 microlitros de PBS por dilución hasta alcanzar un factor de 1 por 10 a menos 8. A continuación, etiquete cada fila de una placa BHI cuadrada precalentada con la concentración de dilución adecuada y con la placa inclinada en un ángulo de 45 grados, agregue 10 microlitros de cada dilución en filas individuales en la parte superior de la placa. Deje que cada muestra se ejecute hasta que casi llegue al fondo de la placa antes de colocar la placa plana. Cuando las muestras hayan sido absorbidas por el agar, transfiera la placa a una incubadora a 37 grados Celsius. Las colonias deberían comenzar a ser visibles después de ocho horas de incubación.

Para obtener una representación precisa de la concentración en la muestra, cuente la fila que tiene entre 10 y 100 colonias.