Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo

La vitrificación de embriones es una técnica de criopreservación ultrarrápida que enfría los embriones a velocidades extremadamente rápidas a temperaturas ultrabajas, lo que facilita su almacenamiento a largo plazo.

Para comenzar, tome embriones de conejo recolectados en medios adecuados. Incube los embriones con una solución equilibrante que contenga bajas concentraciones de crioprotectores que penetran en las células: etilenglicol o EG y dimetilsulfóxido o DMSO. EG y DMSO se difunden a través de las membranas celulares, reemplazando las moléculas de agua dentro de las células y evitando la formación de cristales de hielo intracelulares.

A continuación, incube los embriones con una solución de vitrificación que contenga concentraciones más altas de EG y DMSO para permitir una permeación adecuada de los crioprotectores y una salida de agua intracelular suficiente, protegiendo las células del daño por congelación.

Acople un portador de pajitas criogénicas estéril a un microdispensador. Con el microdispensador, llene la pajita con el medio deseado hasta el nivel adecuado. Luego, aspire una burbuja de aire, seguida de un volumen mínimo de solución de vitrificación que contenga embriones y otra burbuja de aire.

Aspire el medio nuevamente hasta que la primera fracción de medio humedezca y polimerice el tapón de algodón con recubrimiento en polvo, sellando el extremo de la paja. Cierre el otro extremo con un tapón de pajita hidrofóbico. Los segmentos de aire y medios ayudan a aislar los embriones dentro del portador cerrado.

Sumerja brevemente la pajita en nitrógeno líquido a -196 ° C. El portador garantiza altas velocidades de enfriamiento, solidificando los embriones en una fase amorfa similar al vidrio, mientras que el bajo volumen de solución de vitrificación y crioprotectores utilizados mitigan el estrés osmótico. Los embriones vitrificados, con la actividad metabólica suspendida, pueden almacenarse hasta su uso.

Para la vitrificación embrionaria, sumerja los embriones en una solución de equilibrio durante 2 minutos, seguido de una incubación de 1 minuto en una solución de vitrificación. Al final de la incubación, cargue los embriones en un ministraw de plástico de 125 microlitros y acople el extremo cerrado de la pajuela con un microdispensador apropiado de 1 mililitro. Aspire la base media hasta un tercio de la longitud de la pajita, seguida de una pequeña burbuja de aire.

A continuación, use un microscopio estereoscópico para aspirar los embriones en 40 microlitros de solución de vitrificación, seguido de otra pequeña burbuja de aire en suficiente medio base para mover la primera fracción líquida hasta el extremo de algodón del ministraw. Luego, cierre el extremo abierto del ministraw con un tapón de pajita, sumerja el ministraw directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación y almacene el ministraw en un dewar de nitrógeno líquido.