Name: La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende el método MicroSecure de vitrificación de blastocistos humanos para biología reproductiva. Esta técnica aseptica y cerrada utiliza materiales aprobados por FDA para lograr altas tasas de nacidos vivos con reproducibilidad entre laboratorios.

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MC Schiewe quisiera agradecer al Sr. Bosque Garner en el Centro de Fertilidad de Las Vegas por su experiencia estadística en el análisis y evaluación de los datos anuales de los CDC y SART. Además, los autores desean agradecer a su director médico, el Dr. Robert E. Anderson, por su dedicado apoyo y la fe en nuestras capacidades técnicas y experiencia.

<ol><li>Edgar, D. H., Gook, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+cryopreservation+%28slow+cooling+versus+vitrification%29+of+human+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos.</a> Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).</li>
<li>Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+risk+of+monochorionic+dizygotic+twin+blastocyst+formation+associated+with+early+laser+zona+dissection+of+group+cultured+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos.</a> Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).</li>
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<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196+degrees+C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).</li>
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<li>Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+and+human+blastocysts+using+a+novel+cryoloop+container-less+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique.</a> Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).</li>
<li>Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+shrinkage+of+blastocoeles+using+either+a+micro-needle+or+a+laser+pulse+prior+to+the+cooling+steps+of+vitrification+improves+survival+rate+and+pregnancy+outcome+of+vitrified+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).</li>
<li>Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+open+and+closed+methods+for+vitrification+of+human+embryos+and+elimination+of+potential+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination.</a> Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages%3A+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).</li>
<li>Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/cryopreservation-in-eukaryotes/quality-control-factors-influencing-the-successful-and-reliable-implementation-of-oocyte-and-embryo-">Cryopreservation</a>. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).</li>
<li>Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+safe%2C+simple%2C+and+successful+vitrification+method+for+bovine+and+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts.</a> Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).</li>
<li>Panagiotidis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+vitrification+of+blastocysts+from+an+oocyte-donation+programme%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).</li>
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<li>Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).</li>
<li>Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+survival+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> Cryobiology. 24, 387-402 (1987).</li>
<li>Seki, S., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+warming+rate+on+the+survival+of+vitrified+mouse+oocytes+and+on+the+recrystallization+of+intracellular+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice.</a> Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).</li>
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<li>Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+center+validation+of+routine+blastocyst+biopsy+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Asst.+Reprod.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation.</a> J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).</li>
<li>Liebermann, L., Conaghan, J. <a target="_blank" href="http://embryologists.com/jce161-artificial-collapse-prior-blastocyst-vitrification/">Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes.</a> J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).</li>
<li>Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+warming+increases+survival+of+slow-frozen+sibling+oocytes%3A+a+step+towards+a+single+warming+procedure+irrespective+of+the+freezing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol.</a> Reprod Biomed Online. , (2014).</li>
</ol>

MC Schiewe sirve como miembro de la junta asesora científica para Empresas Innovadoras Cryo y como Director Técnico de California Cryobank. La producción de este video-artículo ha sido pagado por la ovación de la fertilidad. Los autores no tienen acuerdos o conflictos de intereses financieros en competencia a revelar con respecto a la vitrificación de gametos y embriones.

Hoy en día, existe una gran expectativa de lograr la supervivencia de blastocisto completa (&gt; 95%) y alcanzar el éxito de la implantación similar a la de embriones frescos. Algunos grupos han sugerido que las tasas de nacidos vivos de los ciclos de transferencia de embriones vitrificados son quizás incluso más alto que los blastocistos frescos cuando el embrión intacto criopreservados se trasplanta en un útero sano, estimulado no hormonalmente. Nuestros datos indican claramente que la vitrificación mantiene de manera eficaz y fiable la viabilidad del embrión fresco. Además, hemos demostrado que nuestro aséptica, método cerrado, llamado MicroSecure vitrificación (mS-VTF), puede lograr un resultado óptimo comparable o superior a los estándares comerciales (es decir, sistemas de dispositivos abiertos) utilizados en la industria de la fertilización in vitro. La variación se asocia con la repetibilidad técnica y fiabilidad entre las personas que utilizan una multitud de dispositivos / vitrificación métodos. A su vez, esto ha dado lugar a inconsistencies entre los programas de la aplicación de la vitrificación. Por lo tanto, no es sorprendente que la familiaridad dispositivo es un factor importante en cuanto a la aptitud del laboratorio y los resultados exitosos. Es este concepto de &quot;firma técnica&quot; 11 que explica por qué la repetibilidad entre programas puede ser problemático. No sólo el desarrollo de más de una docena de dispositivos comerciales complican este fenómeno, se ha creado problemas de control de calidad. Afortunadamente, los sistemas cerrados de vitrificación, como mS-VTF, Rapid-I, y VitriSafe, ahora están demostrando ser igualmente eficaz para abrir los sistemas de dispositivos 12, 13, 14. MicroSecure VTF es una novela, técnica de vitrificación aséptica desarrollado con facilidad técnica, la fiabilidad y la crio-seguridad en mente. Mediante la combinación de la utilización de dos dispositivos aprobados previamente, compatible con la FDA, es un sistema de vitrificación no comercial wITH la ventaja de tener un bajo costo establecido, en contraste con los dispositivos especializados. Además, su único y prueba de manipulaciones sistema de etiquetado de dos colores interiorizado, así como numerosas otras ventajas de control de calidad, han hecho mS-VTF una atractiva opción global 11. Como dispositivo de VTF no comercial, sin embargo, su aplicación generalizada de la industria está evolucionando lentamente. Sólo a través de la publicación continua de su seguridad, la seguridad y la eficacia clínica ganará mS-VTF utilización cada vez mayor. En agosto de 2014, ante la imposibilidad de adquirir el original paja embriones de 0,3 ml fabricado con un tapón hidrófobo interno, no absorbe, hemos sido capaces de modificar de forma fiable el método mS-VTF. En resumen, las nuevas semen de 0,3 ml / pajuelas de embriones con sus tapones de algodón-PVP fueron adaptados de manera efectiva. Esto se consigue simplemente mediante la creación de un sello interno antes de que el tapón de algodón, evitando así el contacto y el líquido que absorbe laVTF punta de composición abierta (es decir, la flexipette que contiene el embrión o los huevos). Además, si las barras de identificación 40 mm no son accesibles, la cuestión de flotación asociado con las barras más ligeras 30 mm se puede contrapesos mediante dos rodamientos de bolas. Estos pasos adicionales han hecho de la técnica ligeramente menos simple, pero todavía muy eficaz. Hoy en día, la economía y la eficacia son cada vez más importantes preocupaciones, como blastocistos biopsiados son típicamente vitrificados individualmente hasta su estado euploidy se confirma en un informe de la genética. Los blastocistos con una aneuploidía no viable confirmado normalmente se descartan, con el consentimiento del paciente, en cuestión de semanas. Por lo tanto, una mayoría (&gt; 50%) de los dispositivos de VTF se descartan después de almacenamiento a corto plazo, provocando un costo anual escalada cuando se utilizan dispositivos comerciales. En general, mS-VTF es un procedimiento altamente eficaz, fiable y repetible para la criopreservación de blastocistos humanos. El superior de control de calidad de diseño securelY etiquetas y segura almacena los ovocitos / embriones al tiempo que elimina la falta de recuperación y optimizar la supervivencia post-calentamiento y la viabilidad, lo que justifica el uso del sistema como un enfoque universal a la vitrificación de embriones.

La vitrificación es la tecnología asistida más impactante sola reproductiva en la industria de la fertilización in vitro (IVF) ya que el desarrollo de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Hoy en día, los blastocistos son criopreservados sin la pérdida de la viabilidad de los embriones previamente asociados con los métodos convencionales de congelación lenta-1. Con la supervivencia embrionaria post-calentamiento fiable, la industria de la infertilidad se está transformando en el uso preferente de los ciclos de transferencia de embriones criopreservados, que producen los resultados del embarazo similares o superiores tradicional de transferencia de embriones frescos. En asociación con la biopsia de blastocisto y el cribado genético preimplantacional (DGP), la vitrificación se ha convertido en una herramienta clínica fundamental para optimizar los resultados de nacidos vivos sanos a través de la transferencia de embriones euploid solo 2, 3. Vitrificación de embriones murino fue desarrollado a mediados de la década de 1980 4, </sup&gt; 5 y adaptada a la ganadería en 1990 6. Partiendo de la premisa de que las soluciones de vitrificación forman un estado metaestable glasseous, libre de dañar la formación de cristales de hielo, se ha demostrado para preservar de manera más eficiente la integridad celular completa de embriones. Curiosamente, la aceptación prometedora de vitrificación en embriología humana no comenzó a hacerse realidad hasta el siglo 21. Las primeras publicaciones que promueven el uso de la vitrificación coincidieron con el desarrollo de los únicos dispositivos del sistema &quot;abierto&quot; 7, 8, 9. Sin embargo, la adopción de vitrificación en la práctica clínica fue lenta, ya que se produjo en un momento en que las mejoras en la congelación de blastocisto lenta también se estaban produciendo. El éxito de la congelación-velocidad lenta convencional, además de la vitrificación, fueron alineadas con las mejoras en los sistemas de cultivo de embriones, así como con la Incorporation de enfoques colapso blastocele, que mejora tanto la supervivencia global de trophectoderm y, posteriormente, la implantación 10. En la última década, la tecnología de vitrificación ha suplantado rápidamente las prácticas convencionales de congelación. En gran medida, esto era debido al desarrollo de dispositivos de vitrificación especializados. Algunos de estos dispositivos han perjudicado la seguridad general, la eficiencia y la eficacia de la vitrificación clínica mediante la introducción de defectos inherentes de diseño para dispositivos utilizados en la industria de la fertilización in vitro 11. De hecho, los matices de los diferentes dispositivos de introducir una variación significativa entre los programas técnicos, comúnmente conocida como &quot;firmas técnicas&quot; 12. De este modo, revistas científicas, como el Diario de experimentos visualizados (JoVE), pueden servir como un recurso valioso para la demostración de los detalles técnicos, lo que ayudará a reducir la variación del resultado. Otro problema es que s en cursoome embriólogos siguen siendo mal informado, incluso hoy en día, en base a las afirmaciones de que el &quot;enfriamiento ultrarrápido de embriones u ovocitos en un &#39;sistema de vitrificación abierto&quot; (es decir, el contacto embrión directa con nitrógeno líquido (LN 2)) es un requisito previo para la optimización las tasas de éxito &quot;. Claramente, esta creencia es errónea, basada en el éxito probado de sistemas aséptica 13, 14, 15 cerrados. Sobre la base de los principios criobiológicos de vitrificación, la eficacia de la vitrificación es más altamente dependiente de las tasas de calentamiento que en las tasas de 16, 17, 18 de refrigeración. En general, independiente del dispositivo de vitrificación utilizado, la tasa de calentamiento debe ser superior a la velocidad de enfriamiento para asegurar altas tasas de supervivencia. Altas tasas de calentamiento reducen al mínimo la posibilidad de cualquier crecimiento del hielo (es decir, la recrystallization de impurezas nucleadas en la crio-solutions) durante la fase de calentamiento de la desvitrificación. Por supuesto, la estabilidad de la solución de vitrificación (es decir, el tipo y la concentración de agentes crioprotectores utilizados) puede tener un efecto de confusión, pero esto se abordan en una publicación separada 11. Teniendo en cuenta los problemas de las tasas de calentamiento experimenta enfriamiento, MicroSecure de vitrificación (mS-VTF) fue desarrollado en 2008 como un método barato, no comercial, compatible con la FDA que optimiza los aspectos de control de calidad de la vitrificación. Era único en que se ofreció a prueba de falsificaciones, interiorizado, el etiquetado de dos colores. Por otra parte, por la carga y el almacenamiento de los embriones directamente en el flexipette estéril utilizado para el pipeteado (es decir, sin la pipeta a una superficie del dispositivo secundario) y mediante el uso de pajitas de ionómero de resina que sellan completamente de soldadura utilizando un sellador automatizado, variante técnica se ha eliminado efectivamente. Al evaluar la completeness de dispositivos de vitrificación para su posible uso, hay varios factores de control de calidad que se deben tener en cuenta, entre ellos: 1) marcar posibles etiquetas -Se puede adherir de forma segura? Están a prueba de manipulaciones? ¿Ofrecen el potencial de identificación de dos colores? ¿Es necesaria una etiqueta secundaria, y la etiqueta se puede quitar fácilmente para fines de mantenimiento de registros (es decir, la verificación del paciente) post-calentamiento? 2) facilidad técnica embriones -Se puede cargar fácilmente en / sobre el dispositivo de una manera oportuna y simplemente identificados y rastreados post-calentamiento? 3) simplicidad de procedimiento / Repetibilidad -¿La método de vitrificación oferta simplicidad y fiabilidad que permite facilidad de repetibilidad, lo que minimiza la variación entre técnicos (internos) y programas (externos)? 4) 2 LN capacidad de almacenamiento de los dispositivos -¿Puede ser manejado e identificado fácilmente y con seguridad? Sto es surabia espacio potencial eficiente? ¿Ofrece el dispositivo de seguridad y la seguridad de cualquier daño físico o posibles contaminantes como un sistema cerrado aséptico? 5) el potencial de recuperación / Supervivencia -Es el diseño de dispositivos propensos a problemas potenciales en la recuperación garantizada de embriones, y van a vitrificar fiable y mantener la integridad celular post-calentamiento completa? La última preocupación específica a la calidad, la tasa de recuperación, ha sido realmente sorprendente minimizado en los informes publicados; esto se hace por lo general que oculta el resultado desfavorable (es decir, embrión perdido o huevo) en típicamente buenas tasas de supervivencia. Cualquier dispositivo propensos a la recuperación inconsistente (&lt;99%) es seriamente defectuoso y constituye un pasivo de procedimiento. Nuestra aséptica, cerrado método mS-VTF ha sido diseñada estratégicamente para dar cuenta de cada medida de control de calidad. Sin embargo, después de 5 años de éxito clínico superior y 14 de validación, el procedimiento tenía tO sea modificado. Las pajas de embrión de 0,3 mL originales (que poseen un tapón hidrófobo) se retiraron de la industria de la fertilización in vitro y se sustituye con una paja semen 0,3 ml que posee un tapón de algodón / PVP estándar (es decir, re-etiquetado como semen / paja de embriones). En este documento se describen los pasos de procedimiento y estrategias específicas que se necesitan para poner en práctica mS-VTF de forma segura, sencilla y eficaz. Por otra parte, destacamos la modificación (s) que se necesita para tener en cuenta las limitaciones de suministro fiable de, hasta el momento en un contenedor de paja ideales alternativa se vuelve a introducir de nuevo en el laboratorio clínico.

<table><tbody><tr><td>Caña de aluminio</td><td>IVM</td><td>XC055</td><td></td></tr><tr><td>Rodamientos de bolas, 3/32"</td><td>VXB.com</td><td>KIT15977</td> de <td>acero inoxidable</td></tr><tr><td>Pajita de semen/embriones CBS, 0,3 mL</td><td>CryoBioSystems</td><td>25292</td><td>color estéril individual</td></tr><tr><td>, varillas de identificación, 30 mm</td> Tubos de cultivo <td>ponderados</td><td>CryoBioSystems</td><td>019021-26</td></tr>, <tr><td>15 mL</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td>cónicos</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo, 10 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Cryosleeves</td><td>Napgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro, 250 mL</td><td>Fisher Sci.</td><td>09-740-2A</td><td>0.22 y mu; m</td></tr><tr><td>Matraces de Cultivo de Tejidos 50 mL</td><td>Falcon</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Flexipettes, 300 &mu; m ID</td><td>Cocinero Med.</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>Estéril, 20/paquete</td></tr><tr><td>Pinza, grande</td><td>Miltex</td><td>6-30TC</td><td></td></tr><tr><td>Pinza, Astilla - fina</td><td>Miltex</td><td>17-305</td><td></td></tr><tr><td>Cáliz</td><td>IVM</td><td>PA003</td><td></td></tr><tr><td>Termosellador, SYMS 1</td><td>CryoBioSystems</td><td>16399</td><td>110 V o 220 V con adaptador</td></tr><tr><td>Medios tamponados Hepes&nbsp;</td><td>Life Global o</td><td>LGGH-100; 100&nbsp; mL, o</td><td>almacenado a 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>H-HTF; 90126; 100 mL</td><td>con etiquetas AA no esenciales</td></tr><tr><td>, Cryo</td><td>GA International</td><td>CL-23T1</td><td>Varios colores</td></tr><tr><td>Tanque de nitrógeno líquido, 40&nbsp; L</td><td>MVE o Taylor Warton</td><td>varios</td><td>almacenamiento de líquidos &nbsp;</td></tr><tr><td>LN2; Matraz Dewar, 0.5&nbsp; L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-695</td><td>Acero inoxidable</td></tr><tr><td>6 pocillos Custer Platos</td><td>Biogenics</td><td>015/020</td><td>Plasticware por caja</td></tr><tr><td>Pipeta Bombilla, Micro Cap</td><td>Drummond</td><td>Fisher#13681451</td><td>Orificio en el ápice de la bombilla</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351006</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 58 mm</td><td>Nunc</td><td></td> 150288 <td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 100 mm</td><td>Puntas</td><td>de</td> pipeta 351029 <td></td></tr><tr><td>Falcon, ART long</td><td>Fisher Sci.</td><td>02-707-80</td><td>10 - 100 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond o Falcon</td><td>varios</td> dispositivos de <td>pipeteo recargables</td></tr><tr><td>, Stripper</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, serológico 1&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, Serológicas 2&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, Serológicas 5&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, Serológicas 10&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, Quirúrgico Mayo</td><td>Miltex</td><td>5-SC-16</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon, Olympus, Leica</td><td>varias</td><td></td></tr><tr><td>almohadillas de gasa estériles, 4" x 4"</td> <td>Kendall Healthcare</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Suero sintético</td><td>Life Global, o</td><td>LGPS-20; 20 mL, o</td><td>almacenado a 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>SS-99193; 12 x 10 mL</td><td>compra lote de baja endotoxina</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>#S9378</td><td>alícuota en 50&nbsp; matraces mL, 1 año; 
17,1 g/matraz + Medio a 50 mL; 
hace una solución de 1 M; 
Filtro con 0.22 y micro; m unidad</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descongelación</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-TS (&le; 1.0 m sacarosa)</td><td>T1, T2, T3, T4; torado a 2 - 8 &ordm; C para &le; 1 mes después de la apertura</td></tr><tr><td>de Vitrification Solution*,**</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-VS (&ge; 7.9 M [glicerol/EG])</td><td>V1, V2, V3; almacenado a 2 - 8 &ordm; C para &le; 1 mes después de la apertura</td></tr><tr><td colspan="4">* Los aditivos crioprotectores no permeables pueden incluir: sacarosa, ficoll e hialuronato de sodio&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">** Otras preparaciones comerciales suelen ser etilenglicol (EG)/dimetilsulfóxido (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), pero podrían ser EG/propilenglicol (32% v/v; 5,2 M). Las soluciones mixtas se utilizan normalmente para reducir los problemas de criotoxicidad de una solución de molares altos. Las soluciones comerciales suelen incluir una solución ES y VS. La formulación de la preparación comercial suele ser propiedad de los propietarios.</td></tr></tbody></table>

la vitrificación modificada microsecure: un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clínica vitrificación de embriones evolucionado con el desarrollo de dispositivos de vitrificación únicas en el siglo 21 y con la idea errónea de que el enfriamiento ultrarrápido en un sistema &quot;abierto&quot; (es decir, directa LN 2 de contacto) era una necesidad para optimizar el éxito de vitrificación. El dogma que rodea a la importancia de las velocidades de enfriamiento dio lugar a prácticas inseguras están sujetos a variación técnica y para la creación de dispositivos de vitrificación que desatendieron importantes factores de control de calidad (por ejemplo, la facilidad de uso, la repetibilidad, fiabilidad, seguridad etiquetado, seguridad y almacenamiento). La comprensión de los defectos de control de calidad de otros dispositivos permitidos para el desarrollo de un método mS-VTF seguro, seguro, repetible y fiable basado en la minimización de variación intra e inter-técnico. Igualmente importante es que combina la disponibilidad de dos dispositivos compatible con la FDA existentes: 1) un ionómero de paja embrión resina de 0,3 mL con interiorizado, de dos colores, manipulaciones petiquetado azotea con potencial sello soldado repetible; y 2) acortada, comúnmente utilizado, ID 300-m flexipettes estériles para cargar directamente el embrión (s) con el fin de crear un dispositivo de vitrificación global altamente eficaz. Al igual que otros aséptica, se cerraron los sistemas de vitrificación (por ejemplo, alta seguridad de vitrificación (HSV), Rapid-i, y VitriSafe) utilizado con eficacia en medicina reproductiva, microSecure vitrificación (mS-VTF) ha demostrado que puede lograr una alta supervivencia post-calentamiento y el embarazo los resultados con su atención a la simplicidad, y la reducción de la variación técnica. Aunque la paja embrión 0,3 ml que contenía un tapón hidrófobo interno fue sustituido en el comercio con una paja semen estándar que posee pirrolidona algodón de polivinilo (PVP) tapones, mantuvo su composición de resina de ionómero de garantizar el sellado de soldadura. Sin embargo, los tapones de algodón pueden absorber el contenido de líquido embrión de la flexipettes al entrar en contacto. Un método mS-VTF modificado fue adaptado para incluir una soldadura interna adicionalsellar antes de que el enchufe en el lado de carga del dispositivo. El paso técnico incluido en el procedimiento mS-VTF no ha afectado a su aplicación con éxito, como altas tasas de supervivencia (&gt; 95%) y las tasas de embarazo continuará hoy.

1.341 blastocistos vitrificados se calentaron entre 2012 y junio de 2014, y 1.341 embriones recuperados (100%), mientras que sobrevivieron 1.316 (98,1%). blastocistos biopsiados experimentaron sobre la supervivencia del 99,5%. Al transferir predominantemente individual, probado genéticamente, euploid, los embriones vitrificados, hemos sido capaces de alcanzar algunas de las tasas de implantación más altos y las tasas de nacimientos vivos en los EE.UU., independientemente de la edad (Figura 3) 20, de acuerdo con recientes estadísticas nacionales notificadas por el Centro para el control de Enfermedades y la Sociedad de Reproducción Asistida (Tablas 1 y 2). La evaluación de una población de pacientes de buen pronóstico (menos de 35 años de edad) para los ciclos criopreservados por sí solos (Tabla 1), nuestro laboratorio ha superado la media nacional, tanto para las tasas de implantación (es decir, la eficiencia de un embrión para establecer un embarazo) y en última instancia en vivo las tasas de natalidad en más del 30%. Además, la validación / verificación inicial de nuestra paja de almacenamiento modificados a mediados de 2014 el uso de 70 con autorización de investigación, los blastocistos aneuploides re-vitrificados resultado una recuperación del 100% y el 100% de supervivencia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig1.jpg"> Figura 1. Configuración MicroSecure VTF. El plato VTF (A) está montado con 3 filas distintas de soluciones de vitrificación, que utilizan 3 gotas de lavado antes de la colocación en distintas, las gotitas de retención numerados. Además, pipetas individuales con puntas VTF acortados (es decir, flexipettes ID 300-M) se fijan y se organizan en una gradilla de tubos de espuma de poliestireno (B), que se puede girar para uso ordenada. Tenga en cuenta que un conjunto de pipeteado bombilla micropipeta desechable representante está descansando en el bastidor de espuma de poliestireno. arget = "_ blank"&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig2.jpg"> Figura 2. Modificado de blastocistos Sistema de Calificaciones. Nuestro sistema de clasificación de blastocisto Gardner modificado da cuenta de la hernia inducida de células TE para facilitar biopsia de blastocisto. La modificación considera la eclosión prematura de blastocistos completos (A: Grado 3 = menos de 10% herniación) y blastocistos expandidos (B: Grado 4 = hasta 50% hernia), mientras que un blastocisto de eclosión (C) tiene más de 50% hernia 16. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 54871fig3.jpg "/&gt; Figura 3. Resultados del Embarazo comparativos. Durante un intervalo acumulado 1,5 años, los datos de embarazo fueron comparados para evaluar los efectos de la transferencia de blastocistos euploid calentado vitrificados-(n = 172 ciclos / 144 transferencias) en comparación con los ciclos no-PGS (n = 160 ciclos / 153 transferencias) que implican predominantemente fresco transfiere 18. Para nuestros propósitos experimentales, estos datos revelan claramente que los blastocistos vitrificados biopsiados por el procedimiento mS-VTF mantienen su viabilidad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fuente de datos </td><td> # Ciclos </td><td> La media de embriones transferidos # </td><td> Implantación Precios (%) </td><td> Índices de nacimientos vivos (%) </td></tr><tr><td> Lab NB * </td><td> 144 </td><td> 1.2 </td><td> 74.00% </td><td> 74.50% </td></tr><tr><td> Promedio nacional </td><td> 20423 </td><td> 1.7 </td><td> 39.60% </td><td> 44.10% </td></tr><tr><td colspan="5"> * Los datos fueron promediados sobre la base del desempeño de 2014 del Condado de Orange Fertilidad, Sur Centro de Fertilidad de California y el Centro del Sur de California para las clínicas de Medicina Reproductiva utilizando el laboratorio de fertilidad Ovation actual (NB Lab), que fundó el procedimiento de vitrificación microSecure en 2008. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Estadísticas 2014 CDC Assisted Reproductive. los datos de embarazo transferencia de embriones congelados de las mujeres menores de 35 años a partir de la presentación de informes de tres clínicas médicas utilizando nuestro laboratorio de NB en comparación con el promedio nacional de Estados Unidos 2013 de más de 450 clínicas de presentación de informes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Promedios SART Nacionales </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clinic - Estado </td><td> Mujer </td><td> Mujer </td><td> Mujer </td><td> Mujer </td></tr><tr><td></td><td> &lt;35 años </td><td> 35-37 años </td><td> 38-40 años </td><td> 41-42 años </td></tr><tr><td> SCCRM-CA * </td><td> 63,1% </td><td> 58,3% </td><td> 40,6% </td><td> 32,3% </td></tr><tr><td> CCRM-CO * </td><td> 64,7% </td><td> 61,5% </td><td> 40,4% </td><td> 32,2% </td></tr><tr><td> RMA-NJ * </td><td> 63,2% </td><td> 59,7% </td><td> 34,6% </td><td> 18,7% </td></tr><tr><td> Promedio nacional </td><td> 48,6% </td><td> 38,3% </td><td> 24,3% </td><td> 12,3% </td></tr><tr><td colspan="5"> Centro de California SCCRM-Sur para la medicina reproductiva; Centro de CCRM-Colorado por for Reproductive Medicine; y RMA-Reproductive Medicine Associates </td></tr><tr><td colspan="5"> * Estas clínicas líderes han implementado todas predominantemente ciclos de transferencia de embriones vitrificados, en asociación con el examen genético previo a la implantación, en su práctica estándar de la atención al paciente para optimizar el éxito de nacidos vivos por embrión trasplantado. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. 2014 las tasas acumuladas de nacidos vivos, según lo informado por la Sociedad de Reproducción Asistida (SART), de la Clínica de Fertilidad SCCRM utilizando nuestro laboratorio Ovación en Newport Beach, CA, en contraste con otros programas respetados, así como con el SART promedios nacionales.

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

El objetivo general del método de vitrificación de embriones MicroSecure es proporcionar un procedimiento de vitrificación cerrada aséptico seguro, simple pero efectivo para embriones humanos. Este método fue desarrollado para minimizar las variables de control de calidad en la vitrificación de embriones humanos, asegurando así un éxito fiable y reproducible. La principal ventaja de esta técnica es que se esfuerza por eliminar las variaciones técnicas entre biólogos y laboratorios.Nuestra técnica es tan sencilla de realizar que encontramos que el mayor reto para nuestros alumnos es aprender a pipetear embriones sin perderlos. La idea detrás de nuestro método era eliminar la necesidad de dispositivos especializados mediante la adaptación de dos artículos de uso común aprobados por la FDA. Una pajita de almacenamiento ionomérica etiquetada internamente y un flexipet estéril.La demostración visual de esta técnica es extremadamente útil, ya que destaca los consejos básicos que aseguran su aplicación exitosa. Antes de comenzar el procedimiento, coloque la pajuela de semen estéril de 0,3 ml sobre la superficie de teflón del electrodo de un sellador de impulso básico de mesa, justo delante del tapón, para crear un sello interno. Presione el mango para activar el calor, soltando el mango cuando la luz roja esté apagada y se escuche un pitido.A continuación, empuje el tapón de algodón hacia delante contra el sello interior antes de completar la configuración. Para la criodilución y la carga de blastocistos de las muestras, retire la placa de cultivo del paciente de la incubadora y confirme todas las identificaciones de las muestras con una fuente secundaria. Bajo un microscopio estereoscópico, use un flexipet de vitrificación, conocido como punta vit, para mover los blastocistos en gotas de retención individuales en la fila superior de una placa criogénica correspondiente.A continuación, rellene previamente el flexipet con 3 microlitros de solución V1 y dispense la mitad del contenido en el primer embrión. Aspirar el embrión y transferirlo a la primera gota de lavado V1. A continuación, pipetea el embrión dos o tres veces alrededor del perímetro de la gota y elimina el contenido residual de la pipeta fuera de la gota y colócalo en la superficie de la placa.A continuación, mueva el blastocisto a una gota de retención V1 individual y precargue la punta de vit con la siguiente solución V2 antes de pipetear los embriones adicionales con una nueva punta de vit. Después de lavar todos los blastocistos en las gotas V2 y V3 como se acaba de demostrar, limpie la solución residual y las burbujas de la punta de vit fuera de la gota de retención V3 y llene completamente la punta con una solución V3 limpia alrededor del primer embrión. Expulse aproximadamente 1 microlitro del volumen y aspire el blastocisto y la solución V3 restante completamente en la punta de vit.Ahora, retire la punta de la pipeta y utilice una gasa estéril para secar la solución V3 residual de la superficie exterior de la punta vit. El secado de la superficie exterior de la punta es fundamental y no conlleva ningún riesgo adicional de pérdida de embriones. A continuación, inserte primero el extremo de la punta en el extremo abierto de la pajita presellada e invierta la pajita, con el extremo de la etiqueta hacia abajo.Observe la punta en el tapón interior. Deje un espacio de aire de 1 cm en el extremo abierto y luego selle de manera segura para cerrarlo. Cuando todas las pajitas hayan sido selladas, sumérjalas directamente en nitrógeno líquido en un matraz dewar de acero inoxidable y guarde las pajitas en la copa abierta unida al bastón del paciente.Para la elución y dilución de la solución criogénica, coloque la placa de dilución de seis pocillos correspondiente en el centro de una platina de microscopio estereoscópico y una placa de Petri de 60 mm que contenga un baño de calentamiento de sacarosa a 37 grados Celsius a un lado del microscopio. A continuación, aísle la pajita que se va a calentar y sostenga el sello superior de la pajita por encima del nivel del líquido para confirmar la identidad de la muestra. Use unas tijeras de mayonesa para asegurar la pajita debajo del tapón interno, para mantener la punta de vit sumergida en el nitrógeno líquido.Golpee firmemente las tijeras contra el matraz dewar varias veces para desalojar la punta de la pared lateral interior de la pajita como precaución de control de calidad, y levante la pajita al aire ambiente en una orientación horizontal al lado o por debajo de la superficie del estereoscopio. Agarrando el extremo no etiquetado de la pajita, corte la pajita por el tapón interior. A continuación, levante la pajita por encima del plato de baño caliente y vierta la punta de vit en la bañera en un ángulo de 60 grados, hasta que la punta esté completamente extruida.La base del flexipet debe descansar por encima de la pared lateral del plato. Después de 5 a 10 segundos, transfiera la base de la pipeta a un dispositivo de pipeteo de microcápsulas. Inicie un temporizador de cinco minutos.Mientras observa el microscopio, use un dedo índice para cubrir el orificio de la bombilla y apriete suavemente la bombilla para liberar el blastocisto vitrificado de la punta vit en el lavado T1. Después de confirmar la liberación del blastocisto, limpie la solución residual V3 y las burbujas mediante presión positiva, evacuando el contenido al centro de un pozo de desecho no utilizado. Transfiera la punta de vit a una pipeta sterber, moviendo el embrión a la segunda gota T1 bajo aceite durante los cuatro minutos restantes.Durante la incubación, llene previamente el flexipet con la siguiente solución, luego diluya el blastocisto en las gotas T2, 3 y 4 a intervalos de tres minutos. Finalmente, equilibre los blastocistos en la gota T5 durante cinco minutos en una superficie de 37 grados Celsius, antes de devolverlos a la incubadora. El sistema de clasificación de blastocistos de Gardner modificado considera que los blastocistos completos tienen menos del 10% de herniación de las células del trofoectodermo, mientras que los blastocistos con hasta un 50% de herniación se clasifican como expandidos.Los blastocistos que muestran una hernia superior al 50% se consideran eclosionadores. Utilizando los métodos demostrados de criopreservación y calentamiento, se han logrado sistemáticamente altos niveles de nacidos vivos por inicio de ciclo con o sin pruebas genéticas preimplantacionales. Aunque estos éxitos son apreciablemente mayores, utilizando blastocistos euploides preseleccionados.De hecho, al evaluar una población de pacientes de buen pronóstico solo para ciclos criopreservados, estos datos de transferencia de embriones congelados demuestran mejores tasas de éxito que el promedio nacional tanto para la implantación como para las tasas de nacidos vivos en más del 30%. independientemente de la edad, se han logrado, en comparación con las estadísticas nacionales recientes reportadas por el Centro para el Control de Enfermedades de otras dos clínicas de fertilidad muy respetadas, y los datos publicados por la Sociedad de Tecnologías de Reproducción Asistida. La vitrificación MicroSecure es un novedoso procedimiento aséptico desarrollado teniendo en cuenta la facilidad técnica, la fiabilidad y la crioseguridad. Este sistema de vitrificación simple y no comercial ofrece una alternativa altamente efectiva y de bajo costo a los dispositivos de vitrificación.Desde su desarrollo, el método MicroSecure ha garantizado una recuperación embrionaria de más del 99,9% y una supervivencia completa de blastocisto de más del 95%. Esto ha permitido la transformación de nuestra práctica clínica en casi todos los ciclos de transferencia de embyro criopreservados en los últimos tres años. Hemos modificado efectivamente nuestro procedimiento para incluir un sello interior frente al tapón de algodón de las pajitas de semen ionomérico para seguir produciendo sellos de soldadura confiables y excelentes resultados posteriores al calentamiento.Hoy en día, se utilizan muchos sistemas de dispositivos diferentes en las industrias de tecnología de reproducción asistida, pero ningún otro dispositivo ofrece la simplicidad y la repetibilidad técnica para eliminar esencialmente la variación del usuario y proporcionar una seguridad optimizada, como la vitrificación MicroSecure.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

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