La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

El objetivo general del método de vitrificación de embriones MicroSecure es proporcionar un procedimiento de vitrificación cerrada aséptico seguro, simple pero efectivo para embriones humanos. Este método fue desarrollado para minimizar las variables de control de calidad en la vitrificación de embriones humanos, asegurando así un éxito fiable y reproducible. La principal ventaja de esta técnica es que se esfuerza por eliminar las variaciones técnicas entre biólogos y laboratorios.

Nuestra técnica es tan sencilla de realizar que encontramos que el mayor reto para nuestros alumnos es aprender a pipetear embriones sin perderlos. La idea detrás de nuestro método era eliminar la necesidad de dispositivos especializados mediante la adaptación de dos artículos de uso común aprobados por la FDA. Una pajita de almacenamiento ionomérica etiquetada internamente y un flexipet estéril.

La demostración visual de esta técnica es extremadamente útil, ya que destaca los consejos básicos que aseguran su aplicación exitosa. Antes de comenzar el procedimiento, coloque la pajuela de semen estéril de 0,3 ml sobre la superficie de teflón del electrodo de un sellador de impulso básico de mesa, justo delante del tapón, para crear un sello interno. Presione el mango para activar el calor, soltando el mango cuando la luz roja esté apagada y se escuche un pitido.

A continuación, empuje el tapón de algodón hacia delante contra el sello interior antes de completar la configuración. Para la criodilución y la carga de blastocistos de las muestras, retire la placa de cultivo del paciente de la incubadora y confirme todas las identificaciones de las muestras con una fuente secundaria. Bajo un microscopio estereoscópico, use un flexipet de vitrificación, conocido como punta vit, para mover los blastocistos en gotas de retención individuales en la fila superior de una placa criogénica correspondiente.

A continuación, rellene previamente el flexipet con 3 microlitros de solución V1 y dispense la mitad del contenido en el primer embrión. Aspirar el embrión y transferirlo a la primera gota de lavado V1. A continuación, pipetea el embrión dos o tres veces alrededor del perímetro de la gota y elimina el contenido residual de la pipeta fuera de la gota y colócalo en la superficie de la placa.

A continuación, mueva el blastocisto a una gota de retención V1 individual y precargue la punta de vit con la siguiente solución V2 antes de pipetear los embriones adicionales con una nueva punta de vit. Después de lavar todos los blastocistos en las gotas V2 y V3 como se acaba de demostrar, limpie la solución residual y las burbujas de la punta de vit fuera de la gota de retención V3 y llene completamente la punta con una solución V3 limpia alrededor del primer embrión. Expulse aproximadamente 1 microlitro del volumen y aspire el blastocisto y la solución V3 restante completamente en la punta de vit

Ahora, retire la punta de la pipeta y utilice una gasa estéril para secar la solución V3 residual de la superficie exterior de la punta vit. El secado de la superficie exterior de la punta es fundamental y no conlleva ningún riesgo adicional de pérdida de embriones. A continuación, inserte primero el extremo de la punta en el extremo abierto de la pajita presellada e invierta la pajita, con el extremo de la etiqueta hacia abajo.

Observe la punta en el tapón interior. Deje un espacio de aire de 1 cm en el extremo abierto y luego selle de manera segura para cerrarlo. Cuando todas las pajitas hayan sido selladas, sumérjalas directamente en nitrógeno líquido en un matraz dewar de acero inoxidable y guarde las pajitas en la copa abierta unida al bastón del paciente.

Para la elución y dilución de la solución criogénica, coloque la placa de dilución de seis pocillos correspondiente en el centro de una platina de microscopio estereoscópico y una placa de Petri de 60 mm que contenga un baño de calentamiento de sacarosa a 37 grados Celsius a un lado del microscopio. A continuación, aísle la pajita que se va a calentar y sostenga el sello superior de la pajita por encima del nivel del líquido para confirmar la identidad de la muestra. Use unas tijeras de mayonesa para asegurar la pajita debajo del tapón interno, para mantener la punta de vit sumergida en el nitrógeno líquido.

Golpee firmemente las tijeras contra el matraz dewar varias veces para desalojar la punta de la pared lateral interior de la pajita como precaución de control de calidad, y levante la pajita al aire ambiente en una orientación horizontal al lado o por debajo de la superficie del estereoscopio. Agarrando el extremo no etiquetado de la pajita, corte la pajita por el tapón interior. A continuación, levante la pajita por encima del plato de baño caliente y vierta la punta de vit en la bañera en un ángulo de 60 grados, hasta que la punta esté completamente extruida.

La base del flexipet debe descansar por encima de la pared lateral del plato. Después de 5 a 10 segundos, transfiera la base de la pipeta a un dispositivo de pipeteo de microcápsulas. Inicie un temporizador de cinco minutos.

Mientras observa el microscopio, use un dedo índice para cubrir el orificio de la bombilla y apriete suavemente la bombilla para liberar el blastocisto vitrificado de la punta vit en el lavado T1. Después de confirmar la liberación del blastocisto, limpie la solución residual V3 y las burbujas mediante presión positiva, evacuando el contenido al centro de un pozo de desecho no utilizado. Transfiera la punta de vit a una pipeta sterber, moviendo el embrión a la segunda gota T1 bajo aceite durante los cuatro minutos restantes.

Durante la incubación, llene previamente el flexipet con la siguiente solución, luego diluya el blastocisto en las gotas T2, 3 y 4 a intervalos de tres minutos. Finalmente, equilibre los blastocistos en la gota T5 durante cinco minutos en una superficie de 37 grados Celsius, antes de devolverlos a la incubadora. El sistema de clasificación de blastocistos de Gardner modificado considera que los blastocistos completos tienen menos del 10% de herniación de las células del trofoectodermo, mientras que los blastocistos con hasta un 50% de herniación se clasifican como expandidos.

Los blastocistos que muestran una hernia superior al 50% se consideran eclosionadores. Utilizando los métodos demostrados de criopreservación y calentamiento, se han logrado sistemáticamente altos niveles de nacidos vivos por inicio de ciclo con o sin pruebas genéticas preimplantacionales. Aunque estos éxitos son apreciablemente mayores, utilizando blastocistos euploides preseleccionados.

De hecho, al evaluar una población de pacientes de buen pronóstico solo para ciclos criopreservados, estos datos de transferencia de embriones congelados demuestran mejores tasas de éxito que el promedio nacional tanto para la implantación como para las tasas de nacidos vivos en más del 30%. independientemente de la edad, se han logrado, en comparación con las estadísticas nacionales recientes reportadas por el Centro para el Control de Enfermedades de otras dos clínicas de fertilidad muy respetadas, y los datos publicados por la Sociedad de Tecnologías de Reproducción Asistida. La vitrificación MicroSecure es un novedoso procedimiento aséptico desarrollado teniendo en cuenta la facilidad técnica, la fiabilidad y la crioseguridad. Este sistema de vitrificación simple y no comercial ofrece una alternativa altamente efectiva y de bajo costo a los dispositivos de vitrificación.

Desde su desarrollo, el método MicroSecure ha garantizado una recuperación embrionaria de más del 99,9% y una supervivencia completa de blastocisto de más del 95%. Esto ha permitido la transformación de nuestra práctica clínica en casi todos los ciclos de transferencia de embyro criopreservados en los últimos tres años. Hemos modificado efectivamente nuestro procedimiento para incluir un sello interior frente al tapón de algodón de las pajitas de semen ionomérico para seguir produciendo sellos de soldadura confiables y excelentes resultados posteriores al calentamiento.

Hoy en día, se utilizan muchos sistemas de dispositivos diferentes en las industrias de tecnología de reproducción asistida, pero ningún otro dispositivo ofrece la simplicidad y la repetibilidad técnica para eliminar esencialmente la variación del usuario y proporcionar una seguridad optimizada, como la vitrificación MicroSecure.