La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar embriones de ratón en nitrógeno líquido y descongelarlos para la recuperación de ratones vivos. Esto se logra sumergiendo primero los embriones de ratón en un medio de equilibrio, transfiriéndolos al medio de vitrificación en un tubo criogénico y luego colocándolos en un tanque de nitrógeno líquido. Posteriormente, los embriones pueden descongelarse en un medio de alta osmótica e incubarse en un medio de cultivo hasta que se transfieran a las hembras receptoras.

En última instancia, los resultados muestran una supervivencia de más del 90% de los embriones después de la vitrificación y tasas de natalidad entre el 30 y el 70% después de la transferencia embrionaria. La principal ventaja de esta técnica es que el glicol crioprotector permeable es menos tóxico para los embriones que el crioprotector convencional. La demostración del procedimiento estará a cargo de un técnico de mi laboratorio antes de comenzar este protocolo.

Preparar dos embriones de ratón celular en cultivo obtenidos por apareamiento natural o técnicas convencionales de FIV a un tubo criogénico para su eventual almacenamiento, añadir 50 microlitros de solución de congelación de embriones EF S 40. Luego prepare una placa de Petri de plástico de 35 milímetros o 60 milímetros con 50 microlitros de temperatura ambiente. EFS 20.

Utilice un capilar de vidrio para transferir hasta 30 embriones a la placa. Tenga cuidado de evitar transferir el medio de cultivo. También para asegurar la deshidratación de los embriones, colócalos en el fondo de la gota.

Después de unos 60 a 90 segundos, use un tubo capilar para extraer los embriones deshidratados. Con una morfología encogida. Transfiera estos embriones a la solución de EFS en el tubo criogénico, transfiriendo la menor cantidad posible de EFS 20.

Una vez transferidos los embriones, deje que se depositen en el EFS 40 durante un minuto antes de congelarlos en nitrógeno líquido. Antes de descongelar los embriones, coloque en una placa de cultivo al menos dos gotas de medio de cultivo de embriones de alta osmolaridad de 10 microlitros, como el medio M 16. Luego, cubra las gotas completamente con silicona o aceite mineral y coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono hasta su uso.

A continuación, caliente la solución TS one a 37 grados centígrados mientras usa una mascarilla y guantes criogénicos. Recupera los embriones del tanque de nitrógeno líquido. Ahora abra rápidamente el tubo criogénico y deseche el nitrógeno líquido en el tanque o en cualquier recipiente apropiado.

Luego espere 30 segundos. Ahora agregue 850 microlitros de solución tibia de TS one al tubo criogénico. Aspire suavemente y expulse la solución unas 10 veces para que se disuelva uniformemente.

Luego transfiera todo el volumen a una placa de Petri de plástico de 60 milímetros. O reloj Glass: espere tres minutos para que los embriones se equilibren a la temperatura ambiente, donde deben permanecer durante el resto del procedimiento. No utilice un dispositivo de calentamiento.

Examine rápidamente los embriones en el plato bajo un microscopio estereoscópico para saber cómo se ven al comienzo de esta incubación. Después de unos dos minutos de incubación, hunda los embriones agitando suavemente el plato hasta que el medio se extienda sobre la superficie del plato. En el último minuto de la incubación, expulse tres gotas separadas de 50 microlitros de solución TS dos en un plato.

Cuando pasen los tres minutos, use un microscopio estereoscópico para confirmar que los embriones se han encogido ligeramente. Si los embriones aún están hinchados, continúe la incubación durante uno a tres minutos más. Ahora, recoja los embriones con un capilar de vidrio y transfiérelos a la primera gota de TS dos.

Espere tres minutos y transfiera los embriones a la segunda gota. Seguido de la tercera gota. Finalmente, recupere el plato de medio para embriones preparado almacenado en la incubadora y use un capilar de vidrio para transferir los embriones a la primera gota del medio.

Si se examinan bajo un estereoscopio, los embriones deberían recuperar lentamente su morfología normal. Ahora, regrese el plato a la incubadora durante unos 10 minutos. A continuación, para lavar la sacarosa que se ha arrastrado de TS dos.

Mover los embriones a la siguiente gota de medio de cultivo. Continúe cultivando los embriones en la incubadora de CO2 hasta que se transfieran a la uc de las hembras receptoras. Después de vitrificar y recuperar entre 300 y 480 embriones de tres cepas diferentes de ratones, la supervivencia fue muy alta.

Después de la descongelación, la fracción de embriones que mostraban una morfología normal estaba entre el 93 y el 99% y de esos embriones al menos el 84% se convirtieron en quistes blásticos. No olvide que trabajar con fugas de nitrógeno puede ser extremadamente peligroso y debe tomar precauciones para evitar el contacto directo y minimizar la exposición a corta distancia a las fugas. El nitrógeno siempre debe tomarse realizando este procedimiento.