Name: La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende a criopreservar embriones de ratón mediante vitrificación con etilenglicol, una técnica simple y de baja toxicidad. Este método alcanza tasas de supervivencia superiores al 90% tras el descongelado.

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Este estudio se llevó a cabo en cooperación con el Proyecto Nacional de bio-recursos, el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón.

El esquema general del experimento se muestra en la fig. 1. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> Hacer que el medio de base (en este caso en la conocida como PB1) en una botella de vidrio de 100 ml de acuerdo con la siguiente tabla a continuación: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 .12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td glucosa></td><td> 180,2 </td><td> 5.56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> La penicilina G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (aprox) </td></tr></tbody></table></li><li> Hacer que el Ficoll-sacarosa (FS): Se <ol><li> Añadir las siguientes sustancias químicas a 14 ml de PB1 solución en un tubo de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mezcla de Ficoll 70 y sacarosa en PB1 solución y agite bien hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Después de comprobar la completa disolución anterior, agregue la BSA sobre la superficie de la solución y mantenerla a4 ° C hasta que se disuelva por completo BSA (&gt; 4 horas o toda la noche). </li></ol></li><li> Hacer que la solución de equilibrio (EFS20) y la solución de vitrificación (EFS40) en un tubo de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) de glicol de etileno, 24% (w / v) Ficoll, y 0,4 mol / L de sacarosa en PB1 con BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) de glicol de etileno, 18% (w / v) Ficoll, y 0,3 mol / L de sacarosa * en PB1 con BSA * Para los embriones de la cepa BALB / c o ICR, aumentar la concentración de sacarosa de 0,9 mol / L de sacarosa, ya que son más sensibles a cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solución </td><td> EFS40 solución </td></tr><tr><td> Etilenglicol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS solución </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Esterilizar la solución por filtración con un 0,45 micras filtranter. Hacer alícuotas en tubos de 5 ml de poliestireno y se almacenan a 4 ° C. Se pueden utilizar durante unos 6 meses. </li><li> Preparación de la solución de descongelación de embriones que contiene 0,75 M de sacarosa (TS1) <ol><li> Disolver 7,7 g de sacarosa en PB1 (preparado en el paso 1.1) y un volumen total de 30 ml. Mezclar por agitación suave hasta que la sacarosa se disuelva por completo. </li><li> Añadir 90 mg de BSA sobre la superficie de la solución y dejar reposar hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Esterilizar la solución por filtración. </li><li> Alícuota y almacena a 4 º C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol> Nota: TS1 también puede ser preparado a partir de M2 ​​disponibles en el mercado. <ol start="6"><li> Disolver 7,7 g de sacarosa en la M2 y un volumen total de 30 ml. </li><li> Mezclar por agitación suave hasta que la sacarosa se disuelva por completo. </li><li> Esterilizar la solución por filtración. </li><li> Alícuota y almacena a 4 ° C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol></li><li> TS2 (solución de descongelaciónque contiene 0,25 M de sacarosa): <ol><li> Diluir 10 ml TS1 con un volumen de 20 ml de PB1 o M2, según el caso. </li><li> Alícuota y almacena a 4 º C. Pueden ser utilizados por cerca de un mes. </li></ol></li></ol> 2. La vitrificación de embriones de ratón de 2 células <ol><li> Prepare dos células de embriones de ratón en el apareamiento natural o convencional en las técnicas de fertilización in vitro. </li><li> Alícuota de 50 l EFS40 en un criotubo. En lo sucesivo, lleve a cabo el resto del procedimiento de vitrificación en la temperatura ambiente. </li><li> Alícuota de 50 l de EFS20 en la parte inferior de 35 mm o 60 mm plato de plástico Petri. </li><li> De transferencia de hasta 30 embriones a EFS20 con un capilar de vidrio con sólo la cantidad mínima de medio de cultivo. Iniciar un temporizador de dos minutos. Nota: Coloque los embriones en la parte inferior de la gota. Esto hace que la deshidratación eficiente de los embriones. Compruebe la morfología de los embriones de un microscopio estereoscópico. Embriones deshidratados muestran una morfología encogido, como se muestra en la fig. 2A.Si no está deshidratado bastante, esperar más 1 o 2 minutos. </li><li> En alrededor de 1,5 min, recoger los embriones a partir de la caída de EFS20 con sólo la cantidad mínima de la solución. Transferirlos a EFS40 en el criotubo preparado en 2,1 paso. Nota: Para obtener los mejores resultados, ajustar el tiempo de recoger los embriones a fin de que todos los embriones pueden ser transferidos a EFS40 en torno a 2 min. </li><li> Esperar durante 1 minuto. </li><li> Ponga el criotubo directamente en nitrógeno líquido (LN 2). </li></ol> 3. Descongelación vitrificados de 2 células de embriones de ratón <ol><li> Antes de descongelar, preparar un plato con 10 gotas l de medio de cultivo de embriones embriones recuperados (véase el paso 3.13). Cubra el plato con aceite y colocar en una incubadora de CO 2 hasta su uso. Nota: Aunque los medios de comunicación para el cultivo de embriones de rutina puede ser utilizado en este experimento, le recomendamos que los medios de comunicación con mayor osmolaridad, como medio de M16. </li><li> TS1 caliente a 37 ° C. </li><li> Ponerse una máscara de la cara y cryogloves. Abra la LN 2 tank y recuperar un criotubo con embriones. </li><li> Abrir rápidamente la parte superior del tubo y desechar LN 2. Espere 30 segundos para evitar TS1 de la congelación en el próximo paso. </li><li> Utilice una pipeta 1000ul añadir 850 l de TS1 (37 ° C) en el tubo y mezclar la solución de pipeteados suave (alrededor de diez veces en 25 segundos) hasta que la solución es uniformemente disuelto. </li><li> Transferencia de la totalidad del volumen del tubo de plástico a un plato de Petri de 60 mm (o un vidrio de reloj) (Fig. 3). Nota: Los embriones deben ser manejados a temperatura ambiente (22-25 ° C) hasta que se colocan en una incubadora de CO 2 en el paso 3.14. </li><li> Iniciar un temporizador de 3 minutos. </li><li> Alrededor de 2 minutos en TS1, agite suavemente el plato hasta que el medio que contiene los embriones se extiende sobre la superficie de la placa (Fig. 3B). Nota: Esto ayudará a los embriones de ir hasta el fondo, ya que están flotando cerca de la superficie cuando se transfiere a TS1. </li><li> Poner tres gotas de 50 l de TS2 en the plato (Fig. 3C). </li><li> Después de 3 minutos en el TS1, comprobar la morfología de los embriones de un microscopio estereoscópico, sino que debe ser un poco encogido. Ver la morfología de los embriones en las primeras (Fig. 2B) y posterior (Fig. 2C) en TS1. Nota: si los embriones son todavía hinchada, mantenerlos en TS1 de 1 hasta 3 min. </li><li> Recoger los embriones y transferirlos a la primera gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar un temporizador de 3 minutos </li><li> Después de 3 minutos, la transferencia de embriones para la segunda caída y luego a la tercera gota (Fig. 3E). </li><li> Transferir los embriones al medio de cultivo preparado en el Paso 3.1. Los embriones están en la forma que se muestra en la fig. 2D. </li><li> Introducir la cápsula en una incubadora de CO 2. A unos 10 minutos más tarde, la transferencia de embriones a la siguiente gota de medio de cultivo para lavar la sacarosa que se ha llevado a más de TS2. </li><li> Al cultivo en un incubador de CO2 hasta que la transferencia de embriones. Nota: Transferencia de Embryos a los oviductos de las hembras receptoras en el día de la descongelación. La cultura a largo in vitro puede disminuir la viabilidad de los embriones en algunas cepas de ratones. </li></ol> 4. Los resultados representativos: In vitro - in vivo y de desarrollo de los embriones después de la descongelación se presentan en las Tablas 1 y 2. Las ventajas de este protocolo son la alta supervivencia de los embriones después de la descongelación y su amplia aplicabilidad a diferentes cepas de ratones. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensión </td><td> N º total de tubos </td><td> N º de embriones vitrificados </td><td> Recuperados (N º (%)) </td><td> Morfológicamente normales (N º (%)) </td><td> El desarrollo de los blastocistos (N º (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. In vitro, el desarrollo de los embriones vitrificados-descongelados en las cepas de ratón común <table border="1"><tbody><tr><td> Condición de los embriones </td><td> N º de hembras receptoras </td><td> N º de embriones transferidos </td><td> Los lugares de implantación (N º (%)) </td><td> Viven descendientes (N º (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrificado </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. En vivo, el desarrollo de los embriones vitrificados-descongelados en ratones C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El esquema general del experimento, con el equilibrio, la vitrificación y descongelación de embriones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La morfología de los embriones en cada etapa de la descongelación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Descongelación de los embriones de procedimiento. Todos los procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente. (A), Añadir 850 l de TS1 (37 ° C) en un criotubo y la transferencia de la totalidad del volumen de la solución en el criotubo en un plato de plástico. En este momento, los embriones vea hinchado, como se muestra en la fig. 2B. (B), se extendió la solución sobre la superficie del plato por agitación suave. (C), colocar tres gotas 50 l de TS2 en el plato de plástico. (D), de transferencia de los embriones a la primera gota de TS2. Después de 3 minutos, los embriones buscar shurunken como se muestra en la fig. 2C. (E), de transferencia de los de seriemente en el resto de TS2 gotas y luego al medio de cultivo.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Desde el primer informe de la vitrificación de embriones de ratón por Rall y Fahy en 1985 2, varias mejoras técnicas se han hecho para aumentar la capacidad de supervivencia de los embriones después de la descongelación. Una de las modificaciones de mayor éxito se logra mediante el uso de glicol de etileno como un crioprotector, debido a su baja toxicidad y alta permeabilidad de la membrana. Estas ventajas nos permiten manejar la congelación de embriones a temperatura ambiente 4; otros métodos de vitrificación de embriones requieren entregar a temperaturas más bajas y no siempre son aplicables a algunas cepas de ratones como BALB / c 6. Vitrificación de etileno primera base de glicol fue desarrollado por Kasai et al. en 1990 5,7. Debido a que el método original fue optimizado para pajillas de plástico como envases, hemos modificado ligeramente el protocolo para criotubos, que son de más fácil acceso en los laboratorios y más resistente a daños físicos. Por lo tanto, el método de vitrificación descritos aquí pueden ser de aplicaciónlicable de muchos laboratorios con ratones como modelos de investigación. El mismo método también se puede utilizar para los embriones de ratón en la mórula y blastocisto etapas 8 y 9 embriones de rata. Sin embargo, recientemente hemos encontrado que la calidad de criotubos puede afectar las tasas de supervivencia de los embriones después de la congelación-descongelación. Por lo tanto, es esencial para examinar la superficie interna de los criotubos por su suavidad antes de la vitrificación de embriones (por ejemplo, ver en la Mesa de reactivos y equipos específicos). Métodos de vitrificación tienen muchas ventajas sobre los métodos convencionales de congelación lenta, pero sí tienen una desventaja con respecto a la finalidad del transporte. Como embriones vitrificados deben mantenerse por debajo de -120 ° C para mantener su viabilidad, cargadores secos se utilizan generalmente para su transporte seguro. Embarcadores secos son pesados ​​y voluminosos, y su ida y vuelta es caro, especialmente para el transporte internacional. Ahora estamos desarrollando un método de vitrificación nuevoque los embriones vitrificados pueden almacenarse a temperatura de hielo seco (alrededor de -80 ° C) durante al menos 7 días 10. Este método debe ser la vitrificación de la próxima generación.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenglicol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sUB&gt; S </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> De MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Criotubo </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogénico&quot; </td></tr></table>

la criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

La criopreservación de embriones de ratón es una base tecnológica que soporta las ciencias biomédicas, ya que muchas cepas de ratones han sido producidos por modificaciones genéticas y el número está aumentando constantemente año tras año. Su desarrollo técnico se inició con los métodos de congelación lenta en la década de 1970 1, seguido de los métodos de vitrificación desarrollada a finales de 1980 2. Por lo general, esta última técnica tiene la ventaja de su rapidez, sencillez y una alta supervivencia de los embriones recuperados. Sin embargo, el contenido crioprotectores son altamente tóxicos y pueden afectar al desarrollo posterior del embrión. Por lo tanto, la técnica no era aplicable a ciertas cepas de ratones, incluso cuando las soluciones se enfría a 4 ° C para mitigar los efectos tóxicos durante la manipulación de embriones. En el Centro RIKEN recursos biológicos, más de 5000 cepas de ratones con diferentes antecedentes genéticos y fenotipos se mantienen 3, y por lo tanto, hemos optimizado un te vitrificaciónchnique con la que podemos criopreservar los embriones de muchas cepas diferentes de ratones, con los beneficios de supervivencia de los embriones de alta después de la vitrificación y descongelación (o licuefacción, más precisamente) a la temperatura ambiente 4. Aquí se presenta un método de vitrificación de embriones de ratón que ha sido utilizado con éxito en nuestro centro. La solución de criopreservación contiene glicol de etileno en lugar de DMSO para minimizar la toxicidad para los embriones de 5. También contiene Ficoll y sacarosa para la prevención de desvitrificación y el ajuste osmótico, respectivamente. Los embriones pueden ser manejados a temperatura ambiente y se introducen en nitrógeno líquido a menos de 5 min. Debido a que el método original fue optimizado para pajillas de plástico como envases, hemos modificado ligeramente el protocolo para criotubos, que son de más fácil acceso en los laboratorios y más resistente a daños físicos. También se describe el procedimiento de descongelación de embriones vitrificados en detalle porque se trata de un ste críticap para la recuperación eficiente de los ratones vivos. Estas metodologías sería útil para los investigadores y técnicos que necesitan la preservación de cepas de ratón para su uso posterior de una manera segura y rentable.

Un etilenglicol basado en el método de vitrificación de embriones de ratón se describe. Es conveniente que otros métodos en su simplicidad y la toxicidad embrionaria bajo, y por lo tanto se puede aplicar ampliamente a muchas cepas de ratones, incluyendo ratones endogámicos y el gen modificado.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

La criopreservación de embriones de ratón es una base tecnológica que sustenta las ciencias biomédicas, ya que se han producido muchas cepas de ratones mediante ingeniería genética...

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar embriones de ratón en nitrógeno líquido y descongelarlos para recuperar ratones vivos. Esto se logra primero sumergiendo los embriones de ratón en medio de equilibrio, transfiriéndolos luego a medio de vitrificación en un tubo criogénico y colocándolos finalmente en un tanque de nitrógeno líquido. Posteriormente, los embriones pueden descongelarse en un medio de alta osmolaridad e incubarse en medio de cultivo hasta que se transfieran a hembras receptoras.En última instancia, los resultados muestran una supervivencia de más del 90 % de los embriones tras la descongelación por vitrificación, y tasas de natalidad entre el 30 y el 70 % tras la transferencia embrionaria. La principal ventaja de esta técnica es que el crioprotector permeable, el glicol, es menos tóxico para los embriones que los crioprotectores convencionales. La realización del procedimiento será demostrada por un técnico de mi laboratorio antes de comenzar este protocolo.Prepare embriones de dos células de ratón en cultivo obtenidos por apareamiento natural o técnicas convencionales de fertilización in vitro (FIV) en un tubo criogénico para almacenamiento futuro; agregue 50 microlitros de solución de congelación de embriones EF S 40. Luego, prepare una placa de Petri plástica de 35 milímetros o 60 milímetros con 50 microlitros de EFS 20 a temperatura ambiente.Utilice una micropipeta de vidrio para transferir hasta 30 embriones al platillo. Tenga cuidado de evitar la transferencia del medio de cultivo. Además, para asegurar la deshidratación de los embriones, colóquelos en la parte inferior de la gota.Después de aproximadamente 60 a 90 segundos, utilice un tubo capilar para aspirar embriones deshidratados. Con una morfología encogida. Transfiera estos embriones a la solución EFS en el tubo criogénico, transfiriendo la menor cantidad posible de EFS 20.Una vez transferidos los embriones, déjelos asentar en el EFS 40 durante un minuto antes de congelarlos en nitrógeno líquido. Antes de descongelar los embriones, coloque en un plato de cultivo al menos dos gotas de medio de cultivo embrionario de alta osmolaridad de 10 microlitros, como el medio M 16. Luego cubra completamente las gotas con aceite de silicona o mineral, y coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono hasta su uso.A continuación, caliente la solución TS uno a 37 grados Celsius mientras usa una mascarilla facial y guantes criogénicos. Retire los embriones del tanque de nitrógeno líquido. Abra rápidamente el tubo criogénico y deseche cualquier nitrógeno líquido en el tanque o en un recipiente adecuado.Luego espere 30 segundos. Ahora agregue 850 microlitros de la solución tibia de TS uno al tubo criogénico. Aspire y expulse suavemente la solución aproximadamente 10 veces para que se disuelva uniformemente.Luego transfiera todo el volumen a una placa de Petri plástica de 60 milímetros. O espere tres minutos en un vidrio de reloj para que los embriones se equilibren a la temperatura ambiente, donde deben permanecer durante el resto del procedimiento. No utilice un dispositivo de calentamiento.Examine rápidamente los embriones en la placa bajo un microscopio estereoscópico para observar cómo se ven al inicio de esta incubación. Después de aproximadamente dos minutos de incubación, hunda los embriones agitando suavemente la placa hasta que el medio se distribuya sobre la superficie de la misma. En el último minuto de la incubación, expulse tres gotas separadas de 50 microlitros de la solución TS dos en una placa.Una vez transcurridos los tres minutos, utilice un microscopio estereoscópico para confirmar que los embriones han encogido ligeramente. Si los embriones aún están hinchados, continúe la incubación durante uno a tres minutos más. Ahora, recoja los embriones con una capilar de vidrio y transfiéralos a la primera gota de TS dos.Espere tres minutos y transfiera los embriones a la segunda gota. A continuación, pase a la tercera gota. Finalmente, retire el plato con medio para embriones preparado que se encuentra almacenado en el incubador, y utilice una capilar de vidrio para transferir los embriones a la primera gota del medio.Si se examinan bajo un estereoscopio, los embriones deben recuperar lentamente su morfología normal. Ahora, devuelva el recipiente al incubador durante aproximadamente 10 minutos. Luego, lave para eliminar la sacarosa que se ha transferido del TS dos.Trasladar los embriones a la siguiente gota de medio de cultivo. Continuar el cultivo de los embriones en el incubador de CO2 hasta que se transfieran al útero de hembras receptoras. Después de vitrificar y recuperar entre 300 y 480 embriones de tres cepas diferentes de ratón, la viabilidad fue muy alta.Después del descongelamiento, la fracción de embriones que mostraban morfología normal fue entre 93 y 99 %, y de esos embriones, al menos el 84 % se desarrollaron en blastocistos. No olvide que trabajar con fugas de nitrógeno puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo y minimizar la exposición a corta distancia con la fuga. El nitrógeno siempre debe manejarse realizando este procedimiento.

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Biología

En este video-artículo se presenta una demostración paso a paso sobre cómo recoger y criopreservar óvulos de hámster con altas tasas de supervivencia después de la descongelación. El mismo procedimiento se puede aplicar para congelar y descongelar con éxito embriones de ratón en las diferentes etapas de desarrollo de preimplantación.

Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón

Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

En este video, describimos el procedimiento para la vitrificación de embriones de conejo cosechados en la etapa de desarrollo deseada utilizando etilenglicol y dimetilsulfóxido como crioprotectores y paja criogénica como sistema portador. Los embriones vitrificados tienen una alta tasa de supervivencia y pueden almacenarse durante un período prolongado hasta su uso.

Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo

Este video muestra el procedimiento para descongelar embriones de conejo vitrificados y los pasos de medición de precaución para una recuperación óptima del embrión.

Descongelación de embriones de conejo: un procedimiento de calentamiento para recuperar embriones de conejo criopreservados para la transferencia de embriones

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Las técnicas de reproducción asistida (ARTs) están en continua evaluación para mejorar los resultados y reducir los riesgos asociados. Este manuscrito describe un procedimiento de transferencia de embriones mínimamente invasivo con un eficiente protocolo de criopreservación que permite el uso de conejos como un modelo animal ideal de reproducción humana.

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.

Morfométricos de protocolo para la evaluación objetiva del comportamiento del blastocisto durante la vitrificación y el calentamiento pasos

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Aquí, presentamos el protocolo Espátula Montevideo para vitrificar embriones de preimplantación de ratones y ovejas, que consiste en una espátula casera y utiliza soluciones caseras. Los embriones se equilibran rápidamente en dos soluciones crioprotectoras de concentración creciente, se cargan en la espátula, se sumergen en nitrógeno líquido y finalmente se sellan con una pajita de 0,5 ml.

Espátula Montevideo Dispositivo para la vitrificación de embriones de mamíferos

Aprende a criopreservar embriones de ratón mediante vitrificación con etilenglicol, una técnica simple y de baja toxicidad. Este método alcanza tasas de supervivencia superiores al 90% tras el descongelado.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

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