Herramientas de edición de bases mediadas por CRISPR: una técnica de edición del genoma para inducir la sustitución de bases dirigida

Para la edición del genoma mediada por CRISPR, comience con el cultivo HAP1-BE3, una línea celular haploide con un gen BE integrado que codifica una enzima editora de bases. A este cultivo, agregue vectores lentivirales que contienen plásmido CRISPR-Cas9 diseñado para un objetivo específico, como el gen del cáncer de mama humano, BRCA1.

La partícula de lentivirus se fusiona con la membrana de la célula huésped, liberando el plásmido, que finalmente se integra en el genoma de la célula huésped para formar los segmentos del gen CRISPR-Cas9-BE. Estos genes generan un ARNg dirigido a BRCA1, endonucleasa Cas9 y BE-citidina desaminasa.

El ARNg dirigido a BRCA1 es un ARN que se fusiona con Cas9 y dirige el complejo al locus del gen BRCA1. Cerca de este gen, el locus es un motivo adyacente protoespaciador, o PAM, donde BE puede acoplarse de manera estable y moverse río arriba para alcanzar su región catalítica activa. Aquí, el BE reconoce una base de citidina y la convierte en uridina.

Esta mutación de sustitución de bases desencadena la nucleasa Cas9 para cortar la cadena de ADN no modificada. La rotura de la cadena de ADN activa las enzimas reparadoras que llenan la base faltante y convierten el uracilo, una base que no es de ADN, en timina. En general, estos procesos generan una variante genética.

Ahora, incubar las células en condiciones fisiológicas y subcultivar para multiplicar la variante genética. Extraiga ADN genómico y secuénelo para analizar la eficiencia de edición de bases mediada por CRISPR.

Siembre 5 x 10 5 células HAP1-BE3 por pocillo en placas de 24 pocillos un día antes de la transfección y cultívelas para alcanzar una confluencia del 70% al 80% para la transfección. Transfecte ARN guía dirigidos a BRCA1 utilizando los reactivos de transfección de compra, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 1 microgramo de ARN guía dirigidos a BRCA1 para inducir la conversión de CG a TA en los sitios diana de BRCA1. Luego, incube las células a 37 grados centígrados y subcultive cada 3 a 4 días. Coseche los gránulos celulares 3, 10 y 24 días después de la transfección para analizar las eficiencias de edición de bases. Extraiga el ADN genómico utilizando el kit de purificación de ADN genómico.