Silencios de BRCA2 Para identificar las funciones biológicas novedosas BRCA2 reguladas en células humanas cultivadas

El silenciamiento génico por siRNA representa una estrategia experimental conveniente para analizar las funciones biológicas dependientes de BRCA2 con implicaciones inmediatas para comprender mejor la biología del cáncer. Se presenta un método para silenciar eficientemente BRCA2, junto con el procedimiento experimental para detectar y cuantificar cambios en la expresión de la proteína BRCA2 por inmunotransferencia en líneas celulares humanas.

El objetivo general de este procedimiento es silenciar la expresión de B RCA dos mediante la transfección de SIR A. Esto se logra preparando primero los complejos de reactivos de transfección SIR a. A continuación, se lleva a cabo una primera ronda de transfección mediante la adición de complejos gota a gota a una monocapa de células que tienen una fluidez del 80%. A continuación, se realiza una segunda ronda de transfección SIR a utilizando una relación SIR, A y reactivo de transfección más alta.

Finalmente, las monocapas celulares se lavan con PBS helado y las células se lisan a cuatro grados centígrados con un tampón de lisis a base de detergente. En última instancia, el análisis de Western blot se utiliza para mostrar el silenciamiento de B RCA A dos a nivel de proteína. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que permite un silenciamiento génico eficiente, así como una detección óptima de proteínas de alto peso molecular como el supresor de tumores B RCA dos Para comenzar después de cultivar capas mono de células epiteliales humanas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una cámara humidificada, retire el medio de crecimiento y use PBS a temperatura ambiente para lavar las células.

Para separar las células de la placa, agregue dos mililitros de solución de EDTA al 0,25% de tripsina y 0,53 milimolares e incube durante tres a cinco minutos, según el tipo de célula. Neutralice la tripsina agregando dos mililitros de medio de crecimiento completo que contenga 10% de FBS antes de transferir las células a un tubo de 15 mililitros. Coloque los tubos en un rotor de cubo oscilante y centrifugue a 320 a 330 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos.

Use cinco mililitros de medio libre de antibióticos para resuspender los gránulos antes de usar una cámara de burker o un sistema de conteo automatizado para contar las células. A continuación, coloque aproximadamente de 0,5 a una vez 10 por las seis células en dos mililitros de medio libre de antibióticos en cada pocillo de placas de seis pocillos e incube durante 24 horas hasta un 80% de fluidez. Después de la incubación, proceda con una primera ronda de transfección diluyendo seis microlitros de reactivo de transfección específico de irna a base de lípidos en 130 microlitros de medio sérico reducido.

Diluir tres microlitros de 10 micromolares de S irna en 130 microlitros de medio sérico reducido. Combine el irna diluido con un reactivo de transfección diluido e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, retire el medio de las células y agregue dos mililitros de medio fresco sin antibióticos.

Precalentar a 37 grados centígrados. A continuación, a 250 microlitros de los complejos de reactivos de transfección de siRNA a cada pocillo de células en una placa de seis pocillos. Luego incube las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Después de 24 horas, diluir cinco microlitros de irna de 10 micromolares en 130 microlitros de medio sérico reducido y proceder con una segunda ronda de transfección que se acaba de demostrar. La alta concentración de sarna en la segunda ronda es esencial para obtener una alta eficiencia de B rca. A dos silenciamientos.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante uno o dos días antes del análisis para preparar el lisado celular para el análisis de inmunotransferencia. Prepare un tampón de lisis fresco de acuerdo con la receta que se muestra aquí. Retire el medio de las celdas y agregue dos mililitros por pocillo de PBS helado para lavar las celdas.

Una vez, retire completamente el PBS de la placa y agregue 200 microlitros de tampón de lisis helada a cada uno. Gire suavemente la placa para distribuir uniformemente el tampón de lisis e incube en un rotador a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Luego, usando un raspador de celdas.

Recoja el lisado celular en un tubo de microcentrífuga en una centrífuga de hielo a 17, 900 Gs y cuatro grados Celsius durante 25 minutos y recoja el supernat para realizar el análisis de inmunotransferencia. Prepare el tampón de funcionamiento diluyendo 50 mililitros de 20 x tampón de ejecución SDS de acetato de tris con 950 mililitros de agua destilada. Prepare la muestra de la siguiente manera.

Agregue 15 microgramos de lisado celular total. Cinco microlitros de cuatro x tampón de muestra que contiene sulfato de litio ESAL pH 8,42 microlitros de DTT 0,5 molar y tampón de lisis hasta un volumen total de 20 microlitros. Desnaturalizar las muestras a 55 grados centígrados durante 10 minutos.

Es crucial utilizar esta temperatura ya que la proteína b RCA dos es termosensible. A continuación, configure la cámara electroforética de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, cargue las muestras en 10 microlitros de un patrón de proteína de retinción de alto peso molecular en un gel prefabricado y hágalo funcionar a 120 voltios durante unas dos horas.

Mientras tanto, prepare el tampón de transferencia con 50 mililitros de tampón de transferencia 20 x, 100 mililitros de metanol al 100% y 850 mililitros de agua. Active la membrana de PVDF sumergiéndola en metanol al 100% durante cinco minutos. Enjuague con agua destilada y equilibre en tampón de transferencia durante al menos cinco minutos.

Remoje las esponjas del aparato de transferencia en un tampón de transferencia a cuatro grados centígrados hasta su uso. Detenga la carrera antes de que el marcador azul de 55 kilodalton salga del gel prefabricado y ensamble el sándwich comenzando con tres esponjas empapadas en tampón de transferencia. A continuación, un papel de tres mm saturado en tampón de transferencia.

A continuación, agregue el gel, luego la membrana de PVDF activado seguida de un papel de grado 3M empapado en tampón y, finalmente, tres esponjas empapadas. Coloque la pila en el aparato y transfiera las proteínas a 350 miliamperios durante cuatro horas y cuatro grados Celsius o a 180 miliamperios y cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la transferencia, use TBS para lavar la membrana y bloquee durante una hora con TBST y leche en polvo descremada al 5%.

A continuación, sustituya el tampón por nueve mililitros de tampón de leche TBST que contenga 30 microlitros de anticuerpo policlonal anti BCA dos conejos e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de usar TBST para lavar la membrana tres veces durante 10 minutos cada una, incube el filtro durante una hora con un microlitro de anticuerpo secundario anti conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en 10 mililitros de tampón de leche TBST. Después de lavar la membrana tres veces, realice la inmunodetección de luminiscencia KEMMA siguiendo las instrucciones del fabricante.

Visualice las bandas en películas ECL de alta resolución para confirmar la especificidad de B rca. A dos silenciamientos. Se utilizó un irna codificado al lado de B RCA dos irna como se muestra aquí como se mencionó anteriormente, es importante realizar una segunda ronda de transfección de irna con una alta proporción de irna a transfección para obtener una alta eficiencia de silenciamiento de B RCA A dos.

Los resultados aquí muestran la diferencia en la eficiencia de knockdown entre el uso de una relación de siRNA bajo y alta para la transfección, dependiendo del tipo de célula. El tiempo mínimo óptimo para obtener el nivel más alto de silenciamiento génico puede variar después de la segunda ronda de transfección de siRNA, por ejemplo, como se muestra en esta figura, 24 horas es suficiente para las células tiroideas NTHY, pero se necesitan hasta 48 horas para un knockdown eficiente de B RCA A dos en PNT un A células de próstata b RCA dos silenciamiento es bastante estable hasta el séptimo día después de la segunda ronda de transfección. Como se mencionó anteriormente, la desnaturalización de los lisados celulares a una temperatura superior a 55 grados centígrados da como resultado una pérdida de hasta el 50% de la proteína B RCA A dos.

En este experimento, se examinó la sensibilidad de las células B RCA A dos células PNT silenciadas y una A al inhibidor de PARP rucaparib después de un tratamiento de 24 horas con el fármaco. Se observó una disminución dependiente del tiempo en la proliferación celular en B, RCA, dos células PNT displetas, una A en comparación con los controles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo silenciar los genes codificadores de proteínas largas por un CRNA y cómo detectar de manera eficiente su producto proteico a través de un procedimiento de bloqueo inmunológico optimizado además de BRC dos.

Este asunto se puede aplicar a muchas otras proteínas grandes desafiantes, particularmente cuando se expresan en niveles muy bajos en las células.