Silencios de
12 de agosto de 2015
El silenciamiento génico por siRNA representa una estrategia experimental conveniente para analizar las funciones biológicas dependientes de BRCA2 con implicaciones inmediatas para comprender mejor la biología del cáncer. Se presenta un método para silenciar eficientemente BRCA2, junto con el procedimiento experimental para detectar y cuantificar cambios en la expresión de la proteína BRCA2 por inmunotransferencia en líneas celulares humanas.
El objetivo general de este procedimiento es silenciar la expresión de B RCA dos mediante la transfección de SIR A. Esto se logra primero preparando los complejos del reactivo de transfección de SIR a. A continuación, se lleva a cabo una primera ronda de transfección añadiendo los complejos gota a gota a una monocapa de células que se encuentran al 80 % de confluencia. Luego, se realiza una segunda ronda de transfección con SIR a utilizando una relación más alta de SIR a respecto al reactivo de transfección.
Finalmente, los monocapas celulares se lavan con PBS frío y las células se lisan a cuatro grados Celsius con un tampón de lisis basado en detergentes. En última instancia, se utiliza el análisis por inmunotransferencia (Western blotting) para demostrar el silenciamiento de B RCA A dos a nivel proteico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite un silenciamiento génico eficiente, así como una detección óptima de proteínas de alto peso molecular, como el supresor tumoral B RCA dos. Para comenzar, tras cultivar monocapas de células epiteliales humanas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono en una cámara humedecida, retire el medio de crecimiento y utilice PBS a temperatura ambiente para lavar las células.
Para separar las células de la placa, agregue dos mililitros de solución de tripsina al 0,25 % y EDTA 0,53 milimolar e incube durante tres a cinco minutos según el tipo de célula. Neutralice la tripsina agregando dos mililitros de medio de crecimiento completo que contenga 10 % de FBS antes de transferir las células a un tubo de 15 mililitros. Coloque los tubos en un rotor con cubetas oscilantes y centrifugue a 320-330 Gs y cuatro grados Celsius durante tres minutos.
Utilice cinco mililitros de medio sin antibiótico para resuspender los pellet antes de contar las células mediante una cámara de Burker o un sistema de conteo automatizado. Luego, siembre aproximadamente de 0,5 a 1 × 10⁶ células en dos mililitros de medio sin antibiótico en cada pocillo de placas de seis pocillos e incube durante 24 horas hasta alcanzar el 80 % de confluencia. Tras la incubación, continúe con una primera ronda de transfección diluyendo seis microlitros de un reactivo de transfección específico basado en lípidos para ARNi en 130 microlitros de medio con suero reducido.
Diluya tres microlitros de ARNi de 10 micromolares en 130 microlitros de medio con suero reducido. Combine el ARNi diluido con un reactivo de transfección diluido e incube de cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, retire el medio de las células y agregue dos mililitros de medio fresco sin antibióticos.
Precaliente a 37 grados Celsius. A continuación, añada 250 microlitros de los complejos del reactivo de transfección de siRNA a cada pocillo de células en una placa de seis pocillos. Luego incube las células en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Después de 24 horas, diluya cinco microlitros de irna 10 micromolar en 130 microlitros de medio con suero reducido y continúe con una segunda ronda de transfección tal como se acaba de demostrar. La alta concentración de sarna en la segunda ronda es esencial para obtener una alta eficiencia de silenciamiento de B rca. A dos.
Incube las células a 37 grados Celsius durante uno o dos días antes del análisis para preparar el lisado celular destinado al análisis por inmunotransferencia. Prepare tampón de lisis fresco según la receta indicada aquí. Retire el medio de las células y agregue dos mililitros por pocillo de PBS frío con hielo para lavar las células.
A continuación, retire por completo el PBS de la placa y agregue 200 microlitros de tampón de lisis frío a cada pocillo. Gire suavemente la placa para distribuir uniformemente el tampón de lisis e incube en un agitador a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Luego, utilizando una espátula para células.
Recolecte el lisado celular en un tubo de microcentrífuga sobre hielo, centrifugue a 17.900 Gs y cuatro grados Celsius durante 25 minutos y recoja el sobrenadante para realizar el análisis de inmunotransferencia. Prepare el tampón de corrida diluyendo 50 mililitros de tampón de corrida de SDS acetato de tris 20x con 950 mililitros de agua destilada. Prepare la muestra como sigue.
Añada 15 microgramos de lisado celular total. Cinco microlitros de tampón de muestra 4x que contiene sulfato de litio ESAL pH 8,42, 2 microlitros de DTT 0,5 molar y tampón de lisis hasta un volumen total de 20 microlitros. Desnaturalice las muestras a 55 grados Celsius durante 10 minutos.
Es fundamental utilizar esta temperatura, ya que la proteína b RCA dos es termosensible. A continuación, prepare la cámara electroforética según las instrucciones del fabricante. Luego, cargue las muestras junto con 10 microlitros de un patrón de proteínas de alto peso molecular en un gel precargado y corra a 120 voltios durante aproximadamente dos horas.
Mientras tanto, prepare el tampón de transferencia con 50 mililitros de tampón de transferencia 20 x, 100 mililitros de metanol al 100 % y 850 mililitros de agua. Active la membrana de PVDF sumergiéndola en metanol al 100 % durante cinco minutos. Enjuáguela con agua destilada y equilibre en tampón de transferencia durante al menos cinco minutos.
Empape las esponjas del aparato de transferencia en tampón de transferencia a cuatro grados Celsius hasta su uso. Detenga la corrida antes de que el marcador azul de 55 kilodalton abandone el gel precolado y arme el sándwich comenzando con tres esponjas empapadas en tampón de transferencia. Luego, un papel de tres mm saturado en tampón de transferencia.
A continuación, agregue el gel, seguido por la membrana de PVDF activada, luego un papel de filtro 3M empapado en tampón y finalmente tres esponjas empapadas. Coloque el conjunto en el aparato y transfiera las proteínas a 350 miliamperios durante cuatro horas a cuatro grados Celsius o a 180 miliamperios y cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la transferencia, lave la membrana con TBS y bloquee durante una hora con TBST y leche descremada al 5 %.
Luego, reemplace el tampón con nueve mililitros de tampón de leche TBST que contiene 30 microlitros de anticuerpo policlonal de conejo anti-BCA dos e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de lavar la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos cada vez, incube el filtro durante una hora con un microlitro de anticuerpo secundario de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en 10 mililitros de tampón de leche TBST. Tras lavar la membrana tres veces, realice la detección inmunológica por quimioluminiscencia siguiendo las instrucciones del fabricante.
Visualice las bandas en películas ECL de alta resolución para confirmar la especificidad de B rca. A dos silenciamiento. Un ARNi desordenado se utilizó al lado de B RCA dos ARNi como se muestra aquí. Como se mencionó anteriormente, es importante realizar una segunda ronda de transfección de ARNi con una alta relación de ARNi a transfección para obtener una alta eficiencia de silenciamiento de B RCA A dos.
Los resultados aquí mostrados indican la diferencia en la eficiencia de silenciamiento entre el uso de una relación baja y alta de ARNpi a transfección, dependiendo del tipo celular. El tiempo mínimo óptimo para alcanzar el mayor nivel de silenciamiento génico puede variar tras la segunda ronda de transfección de ARNpi; por ejemplo, como se muestra en esta figura, 24 horas son suficientes para las células tiroideas NTHY, pero se necesitan hasta 48 horas para un silenciamiento eficaz de B RCA A dos en células prostáticas PNT una. El silenciamiento de B RCA dos es bastante estable hasta el día siete tras la segunda ronda de transfección. Como se mencionó anteriormente, la desnaturalización de los lisados celulares a una temperatura superior a 55 grados Celsius provoca una pérdida de hasta el 50 % de la proteína B RCA A dos.
En este experimento, se examinó la sensibilidad de las células PNT1A silenciadas para BRCA2 a la inhibición de PARP con rucaparib, tras un tratamiento de 24 horas con el fármaco. Se observó una disminución dependiente del tiempo en la proliferación celular en las células PNT1A con déficit de BRCA2 en comparación con los controles. Tras ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo silenciar genes que codifican proteínas largas mediante ARNc y de cómo detectar eficientemente su producto proteico a través de un procedimiento optimizado de inmunodetección, además de BRCA2.
Este enfoque puede aplicarse a muchas otras proteínas grandes y complejas, particularmente cuando se expresan a niveles muy bajos en las células.
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Resumen
Este artículo presenta un método para silenciar la expresión de BRCA2 mediante transfección con siRNA en líneas celulares humanas. El procedimiento incluye la preparación de complejos de reactivos de transfección con siRNA y rondas sucesivas de transfección, seguidas de inmunotransferencia (Western blotting) para evaluar los niveles de la proteína BRCA2.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Silenciamiento génico
- Biología del cáncer
- Análisis de expresión proteica
Antecedentes
- BRCA2 es un gen supresor de tumores clave.
- Comprender su regulación es fundamental para la investigación del cáncer.
- El ARNip proporciona un enfoque dirigido para la silenciación génica.
- La transferencia Western es un método confiable para la detección de proteínas.
Objetivo del estudio
- Silenciar eficazmente la expresión de BRCA2.
- Analizar los efectos del silenciamiento de BRCA2 sobre los niveles de proteína.
- Mejorar las metodologías para estudiar genes relacionados con el cáncer.
Métodos Utilizados
- Preparación de complejos del reactivo de transfección de siRNA.
- Dos rondas de transfección de siRNA en células cultivadas.
- Lavado de células con PBS tras la transfección.
- Transferencia Western para cuantificar la expresión de la proteína BRCA2.
Resultados principales
- Se logró un silenciamiento exitoso de BRCA2.
- El inmunotransferencia confirmó niveles reducidos de la proteína BRCA2.
- El método demostró eficiencia en el silenciamiento génico.
- Se detectaron eficazmente proteínas de alto peso molecular.
Conclusiones
- El método de transfección de siRNA es eficaz para el silenciamiento de BRCA2.
- Este enfoque puede mejorar la comprensión de las funciones de BRCA2.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación en biología del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La silenciación eficiente de proteínas supresoras de tumores de gran tamaño, como BRCA2, permite la interrogación mecanicista de las vías de reparación del ADN en modelos celulares humanos. Este enfoque apoya la validación de dianas al establecer vínculos causales entre la pérdida de BRCA2 y los fenotipos celulares relevantes para el descubrimiento de fármacos en oncología. El protocolo aborda una barrera técnica clave en el estudio de proteínas de alto peso molecular, mejorando la reproducibilidad en los esfuerzos preclínicos de desactivación de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de las vías reguladas por BRCA2 para aclarar los mecanismos de supresor tumoral en cánceres epiteliales.
- Valor operativo: Logra un silenciamiento de BRCA2 superior al 70 % mediante relaciones optimizadas de transfección con siRNA, lo que permite una evaluación confiable del fenotipo.
- Valor científico: Facilita la detección de la proteína BRCA2 endógena mediante desnaturalización a baja temperatura (55 °C), preservando la integridad del epítopo para inmunotransferencia.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor Operativo: El protocolo estandarizado de transfección de ARNsi en dos rondas mejora la eficiencia de transfección para genes grandes, aumentando la robustez del ensayo.
- Valor Científico: Permite obtener lecturas cuantitativas mediante inmunotransferencia de niveles proteicos de BRCA2 para correlacionarlos con resultados funcionales como la sensibilidad a inhibidores de PARP.
- Valor Operativo: Compatible con lisados de bajo contenido, lo que permite ensayos escalables en fases iniciales de validación de dianas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la silenciación de BRCA2 con un aumento de la sensibilidad a inhibidores de PARP (por ejemplo, rucaparib), lo que respalda modelos preclínicos guiados por biomarcadores.
- Valor operativo: El silenciamiento estable durante hasta siete días posteriores a la transfección permite ensayos fenotípicos de curso temporal en estudios de respuesta a fármacos.
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que modela mutaciones de pérdida de función en BRCA2 observadas en tumores.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se enmarca en la fase de biología del descubrimiento, permitiendo la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías antes de la identificación de compuestos activos y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de la función de BRCA2 en las vías de reparación del ADN y estabilidad genómica.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles a nivel proteico, esenciales para la estandarización de ensayos en líneas celulares.
- Análisis: Genera señales detectables de BRCA2 mediante inmunotransferencia optimizada, permitiendo la comparación de la eficiencia de silenciamiento y sus efectos secundarios.
- Investigación Traducional: Relaciona la pérdida de BRCA2 con la sensibilidad a inhibidores de PARP, en concordancia con estrategias de biomarcadores traducionales en modelos de cáncer de ovario y de mama.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otras proteínas grandes y de baja abundancia, posicionándolo como una plataforma reutilizable para clases de dianas difíciles.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los fenotipos relacionados con BRCA2 al permitir la silenciación génica específica y sostenida.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante relaciones estandarizadas de siRNA y lisis a baja temperatura, minimizando la variabilidad en la detección de proteínas grandes.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al validar la dependencia del blanco en modelos preclínicos antes de la inversión en compuestos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos en la vía de reparación del ADN basada en evidencia genética funcional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la optimización de la transfección de siRNA y en inmunotransferencia de proteínas de alto peso molecular.
- Necesita acceso a reactivos de transfección, tampones de lisis y sistemas de electroforesis compatibles con la separación de proteínas grandes.
- Exige la estandarización de las relaciones entre siRNA y reactivo, así como del momento de la transfección en diferentes líneas celulares, para lograr una inhibición constante.
- Implica consideraciones de adaptación frente a los distintos niveles de expresión de BRCA2 y eficiencias de transfección en diversos modelos epiteliales.
- Está limitado por la termosensibilidad de BRCA2, lo que requiere un control preciso de la temperatura durante la preparación de las muestras para evitar la pérdida del epítopo.
