Ensayo de impedancia basado en matrices de tres cámaras: una técnica de análisis en tiempo real para evaluar el potencial invasivo de las células cancerosas mediante la medición de la impedancia eléctrica

Las células estromales asociadas al cáncer secretan factores químicos que pueden desencadenar las células tumorales metastásicas que residen en la membrana basal del tejido. En consecuencia, las células cancerosas invaden la membrana basal y migran hacia el espacio extracelular del tejido.

Para medir la capacidad invasiva de las células cancerosas in vitro, comience con una placa multipocillos con múltiples matrices de tres cámaras. En cada matriz, la cámara inferior tiene un cultivo adherente de células estromales. La cámara superior con microelectrodos de medición de impedancia fusionada (electrodos en miniatura que miden la actividad eléctrica de una célula) está superpuesta por células cancerosas, que se adhieren a la membrana microporosa recubierta de matriz extracelular presente sobre los electrodos.

Durante la incubación en un analizador basado en impedancia, las células estromales liberan factores quimiotácticos en el medio, que se mueven hacia las células cancerosas. Estos factores se mueven a través de la membrana semipermeable presente en la parte inferior de la cámara central.

Los factores secretados por las células estromales indican a las células cancerosas adherentes que se transformen en fenotipos invasivos. En respuesta, las células invasoras migran a través de la membrana microporosa llegando a los electrodos interdigitados en el lado opuesto de la membrana.

Con el tiempo, a medida que más células cancerosas se adhieren a los electrodos, causan impedancia celular, lo que dificulta el flujo de corriente de las células. La medición de la impedancia celular es indicativa del potencial invasivo de las células cancerosas.

Coloque las tres cámaras estériles en la campana de cultivo de tejidos. Ubique la perilla en el lado corto de la cámara inferior y oriente la cámara inferior de modo que la perilla quede frente al experimentador.

Agregue de 30,000 a 50,000 celdas en 90 microlitros de medio a cada pocillo desde la cámara inferior sin formar burbujas. Use un 5% de medios suplementados con suero bovino fetal en dos cámaras inferiores como control positivo de la motilidad celular, y use un medio suplementado con suero al 0% como control negativo.

Gire la cámara inferior a 90 grados después de dejarla reposar durante 10 a 15 minutos en la campana. Luego, coloque la cámara central en la parte superior, de modo que la perilla de la cámara inferior se deslice hacia la muesca de la cámara central. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo, hasta que se escuche un clic en cada uno de los lados largos del conjunto.

Agregue 160 microlitros de medios sin suero a todos los pocillos de la cámara central. Asegúrese de que un menisco en forma de cúpula sea visible después de llenar los pocillos y coloque la cámara superior, con los electrodos hacia abajo, en la cámara central para alinear los puntos azules en las cámaras central y superior. Empuje la cámara verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un chasquido en cada uno de los lados largos del conjunto.

Agregue de 20 a 50 microlitros de medios sin suero a la cámara superior. Monte el conjunto en el analizador celular de doble propósito en la incubadora de cultivo de tejidos y espere 30 minutos antes de medir el fondo.

Abra el software del analizador de celdas, luego seleccione la base que se utilizará, seguido de un clic en la pestaña 'Mensaje' y asegúrese de que diga 'Conexiones correctas' para asegurarse de que la matriz esté bien colocada en la base y que los electrodos estén bien alineados con los sensores.

Haga clic en la pestaña 'Notas del experimento' y complete toda la información posible sobre el experimento. Luego, haga clic en la pestaña 'Diseño' y complete la descripción del diseño de la matriz. Luego, haga clic en la pestaña 'Programar' y agregue dos pasos desde el menú 'Pasos'; un paso de fondo con un barrido y un paso de prueba con 100 barridos.

Una vez que la matriz haya estado en la incubadora del analizador de células de doble propósito durante 30 minutos, haga clic en el botón "Reproducir" para iniciar la medición en segundo plano.

Una vez realizada la medición en segundo plano, retire la matriz de la base y vuelva a colocarla en la campana de cultivo celular. Luego, agregue de 30,000 a 50,000 células en 100 microlitros de medios sin suero a cada pocillo de la cámara superior. Estas son las células que el electrodo detectará una vez que migren con éxito a través de la membrana.

Deje reposar el conjunto en la campana durante 30 minutos antes de montarlo en el analizador de celdas de doble propósito para la medición de impedancia.

Vuelva a colocar la matriz en el analizador de celdas de doble propósito y verifique la pestaña 'Mensaje' para ver el mensaje 'Conexiones correctas'. Haga clic en el botón 'Reproducir' para iniciar la medición de impedancia y luego haga clic en la pestaña 'Trazar' para monitorear el progreso de la señal.

Si se llega al punto final antes de las 25 horas, haga clic en el paso 'Abortar' del menú desplegable 'Ejecutar'. Para exportar datos, haga clic con el botón derecho en el gráfico, elija 'Copiar' en el formato de lista y luego pegue los datos en una hoja de cálculo.