Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar la detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica conocida como eis para caracterizar los comportamientos celulares. Esto se logra mediante el crecimiento de células en electrodos en una matriz y la toma de medidas en diferentes modos para cuantificar la formación, maduración y manipulación de la función de la barrera endotelial, como el herido eléctrico y la adición de estimulantes, para probar la motilidad celular y la función de barrera. Se obtienen resultados que describen la adhesión celular, proliferación, migración, detección de permeabilidad endotelial y evaluación de los contactos de células, células y sustratos celulares basados en esis.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como proporcionar generación en línea de datos cuantitativos, caracterizar las células en su estado de confluencia natural en sus condiciones estándar de cultivo celular. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque la teoría subyacente parece compleja y deben tener en cuenta varias consideraciones básicas antes de comenzar un experimento. Para empezar, las matrices deben limpiarse y estabilizarse para evitar la deriva de los electrodos, mejorar la reproducibilidad y aumentar la relación de intensidad de la señal.

Por lo tanto, agregue 200 microlitros de EL EL de 10 milimolares a cada pocillo de un conjunto de ocho pocillos después de 15 minutos A temperatura ambiente, elimine la cistina EL con dos lavados con agua ultrapura, no con tampones de fosfato. Además, no exponga los electrodos a soluciones que contengan suero antes del recubrimiento, ya que pueden interferir con la absorción de proteínas. A continuación, agregue 200 microlitros de gelatina al 1% calentada a cada pocillo e incube la matriz durante media hora a 37 grados centígrados.

Para eliminar la gelatina, use agua ultrapura y no permita que las superficies de los electrodos se sequen. Luego llene los pocillos con 400 microlitros de medio de cultivo completo, que ahora puede contener suero. Cargue la matriz en el soporte.

Revisa los nueve cuadrados dorados. Deben ponerse en contacto con los pines POGO. Asegure con cuidado la matriz en su lugar con la mano, apretando el tornillo de ajuste de la computadora.

Abra el software de medición. Presione configurar y luego verifique en la sección de recopilación de datos para realizar una medición rápida de impedancia de cada pozo a la frecuencia predeterminada de 4, 000 hercios. Los valores se almacenarán en la sección de comentarios.

Asegúrese de que la verificación haya seleccionado con precisión el tipo de matriz de EIS en uso en la sección de configuración del pozo en el diagrama de la matriz. El rojo y el verde indican la funcionalidad de las conexiones. Si la limpieza y la codificación se realizaron correctamente, ocho matrices de sistemas W one E deberían registrar entre cinco y seis matrices NANOFAAD y ocho matrices W 10 E.

La resistencia de referencia de 50 a 60 nanofaradios antes de la siembra celular es, por lo tanto, de aproximadamente 2000 ohmios. Para modelar los datos mediante RB alfa y cm, inicie una grabación MFT con la matriz de error medio. Tome 15 minutos de datos sin celdas y termine el experimento para agregar las celdas.

Ahora retire la matriz y siembre 400 microlitros de suspensión de una sola célula en cada pocillo. Para estudiar las semillas de crecimiento celular, 10.000 células por centímetro cuadrado para empezar con una semilla de población casi confluente, 60.000 células por centímetro cuadrado. Después de cargar la matriz en el soporte, en la sección de configuración de pozos, seleccione los pozos que desea medir.

A continuación, vaya a las opciones de recopilación de datos y seleccione un modo de medición para una serie temporal a una frecuencia fija, seleccione SFT, y elija la frecuencia de medición para medir la cobertura de electrodos y el modelo RB y alpha seleccione MFT y el dispositivo tomará medidas automáticamente en todas las frecuencias disponibles. Ejecute la medición en modo multifrecuencia siempre que sea posible. Esto requiere datos en todas las frecuencias disponibles y, por lo tanto, proporciona la mayoría de los conocimientos.

Para el análisis de micromovimiento, seleccione RTC y ajuste la frecuencia de muestreo. La resolución temporal estándar es de un hercio, pero se puede aumentar para rastrear cambios rápidos en la impedancia. El valor se puede aumentar a 25 hercios para el z theta.

Para medir el micromovimiento secuencialmente desde muchos pocillos, seleccione el menú de ayuda. A continuación, elija Mostrar elementos de menú de la barra de herramientas de experto y adquirir y RTC de pozos múltiples. En la sección de recopilación de datos, asegúrese de especificar el límite de tiempo en horas.

Al utilizar esta configuración, el software solicitará el número de ciclos después de iniciar la adquisición de datos. Al recopilar datos mediante SFT o MFT, seleccione el intervalo de tiempo entre mediciones especificado en segundos. Para obtener la máxima adquisición de datos, deje esta opción sin marcar.

Ahora presione inicio y especifique dónde se deben almacenar los datos. La ejecución se detiene pulsando finalizar. Al pulsar pausa, la adquisición de datos se detendrá, pero el reloj experimental seguirá funcionando.

Ahora retire el conjunto y, bajo una campana de flujo laminar, manipule los pozos. Después de devolver la matriz al soporte, haga clic en comprobar conexión para verificar las conexiones eléctricas y, a continuación, en reanudar el experimento para continuar recopilando datos. Si no es necesario que las células sean estériles después de la manipulación, entonces un estímulo como la trombina se puede agregar directamente a un pocillo durante la adquisición de datos.

Dichas variaciones introducidas se pueden marcar en el reloj experimental pulsando la marca y añadiendo un comentario. Otra opción es enrollar eléctricamente las células. Los ajustes para esto necesitan algunos ajustes para llegar a un tiempo de herida corto y no es efectivo demasiado tiempo, y puede dañar los electrodos.

Simplemente comience con la configuración predeterminada que proporciona el software y continúe desde allí. Vaya a la sección de configuración del desfile eléctrico herido y habilite la herida. Ahora seleccione los pozos para enrollar en la configuración de pozo.

Solo se dañarán los pozos revisados. Al hacer clic en activar, aparece una ventana emergente para solicitar heridas. Después de herir, compruebe que la señal desciende a un valor de un electrodo casi sin celdas.

Si no se repitió el herido generalmente para trabajar con los datos, use la opción de exportación de datos y seleccione Excel. Sin embargo, el modelado RB y alfa se puede realizar desde el software. A partir de los datos de MFT, recuerde que el modelado solo es válido en capas de celdas de confluencia.

Y no olvide agregar la referencia sin celdas. Comience seleccionando automáticamente una referencia sin celdas utilizando la función de búsqueda en la sección de modelado y análisis de escaneo de frecuencia. Acepte el valor con set.

A continuación, presione modelo para iniciar los cálculos. No se alarme si esto tarda varios minutos. Durante un experimento típico, las células pasan de una fase de crecimiento a una fase de meseta.

Cuando alcanzan la confluencia, las imágenes se adquieren directamente del electrodo durante este proceso. La siguiente fase es la formación y maduración de la barrera EC. A continuación, se utilizan heridas eléctricas para estudiar la migración de las células.

A una caída característica de la señal con respecto a la línea de base le sigue el restablecimiento del estado de confluencia. Por último, se hace un seguimiento de la respuesta a los estímulos en tiempo real. En este caso, se aplicó el agente vasoactivo trombina.

Esto provocó una contracción celular y, por lo tanto, una apertura transitoria de pequeños espacios en la barrera, lo que provocó una caída en la resistencia a la impedancia y las mediciones de capacitancia proporcionan información complementaria sobre la adhesión celular y la resistencia al crecimiento en la medición más sensible. La frecuencia representa la calidad y la función de la barrera celular y tiene en cuenta la resistencia al flujo de corriente paracelular y transcelular. Cuando las celdas se conectan a los electrodos, restringen el flujo de corriente y la capacitancia cae proporcionalmente.

Esta fase proporciona una medición general de la cobertura del electrodo y se cuantifica mejor cuando se registra la capacitancia a una frecuencia superior a 40 kilohercios. La resistencia da una idea clara de cómo las buenas celdas pueden bloquear el flujo de corriente y, por lo tanto, la calidad de la barrera celular. Por lo tanto, las células de diferentes pasajes y diferentes tipos tienen diferentes resistencias.

Nuestro RB y alfa ayudan a distinguir entre las adherencias de la célula y de la matriz celular. RB es la resistividad de los contactos de la celda con el flujo de corriente, o una medida inversa de la permeabilidad. Alpha es una medida de las contribuciones de impedancia de las uniones de los electrodos de la celda.

Tanto el valor RB como el alfa se pueden calcular desde el software ISIS. Las pequeñas fluctuaciones en la señal de resistencia pueden deberse a movimientos sutiles en la capa de la célula de confluencia o a micromovimientos. Se pueden medir con una matriz E a la frecuencia más sensible y se pueden analizar mediante una transformación rápida de Fourier dentro de las manipulaciones de software de EIS que brindan información sobre el comportamiento celular con precisión.

Por ejemplo, es posible hacer una bobina eléctrica de 250 micras que se cerrará en unas pocas horas para estudiar la migración celular. La espectroscopia de impedancia también es adecuada para analizar el efecto de las sustancias añadidas. Como se señaló anteriormente, la trombina hace que la barrera celular sea hiperpermeable al reducir la tensión basal de las células con el inhibidor de la ARO quinasa, el efecto de la trombina podría disminuir. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que ESIS es extremadamente sensible a los cambios en el entorno celular como la temperatura, el pH, el agotamiento del medio, etc.

Después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ología estudiaran las tendencias y los efectos de los agentes vasoactivos en los cultivos celulares de confluencia en tiempo real.