PCR anidada para detectar una secuencia genómica viral específica

La reacción en cadena de la polimerasa anidada, PCR anidada, puede amplificar selectivamente secuencias de genes específicos.

Para detectar una secuencia viral diana, comience con una mezcla maestra que contenga cebadores externos complementarios a una región de ADN más grande que contenga la secuencia viral objetivo, dNTP y ADN polimerasa termoestable en un tampón apropiado.

Agregue ADN viral de doble cadena, extraído de las células infectadas por el virus, a esta mezcla. Transfiera el tubo a un termociclador; ejecutar el primer ciclo de PCR.

Durante la desnaturalización, el ADN bicatenario produce dos plantillas monocatenarias. A una temperatura de recocido adecuada, los cebadores exteriores se unen a sus secuencias objetivo correspondientes. Más tarde, la ADN polimerasa extiende los cebadores utilizando dNTP, produciendo amplicones grandes, que contienen la secuencia específica dentro del ADN amplificado.

Transfiera estos amplicones a un nuevo tubo. Complemente con una mezcla maestra fresca que contenga cebadores internos o anidados dirigidos a una secuencia más pequeña y específica dentro del ADN amplificado más grande. Ejecute la segunda PCR.

Durante la segunda PCR, la hebra de ADN se desnaturaliza. Después de la desnaturalización, los cebadores anidados se unen a los sitios objetivo en la plantilla monocatenaria, seguida de una extensión del cebador mediada por polimerasa.

Repita el segundo ciclo de PCR varias veces para amplificar exclusivamente la secuencia viral objetivo.

Analizar el producto de PCR para visualizar los amplicones más pequeños, confirmando la presencia de la secuencia viral específica.

Recupere los reactivos necesarios y manténgalos en hielo en una habitación limpia hasta que estén listos para usar. Cuando esté listo, descongele y agite los reactivos. A continuación, prepare 48 microlitros de mezcla de PCR de primera ronda para cada muestra en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, como se describe en la Tabla 2 del protocolo de texto, y divida la mezcla de reacción en tubos de PCR de 0,2 mililitros.

En una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas, agregue una muestra de 2 microlitros del ADNc a la mezcla de PCR de primera ronda. Incluya dos microlitros de ADNc CVS-11 como control positivo y dos microlitros de agua doble destilada como control negativo. Luego, transfiera los tubos sellados a un termociclador de PCR y realice un ciclo utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto.

Para comenzar, prepare 48 microlitros de mezcla de PCR de segunda ronda para cada muestra en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, como se describe en la Tabla 4 del protocolo de texto, y divida la mezcla de reacción en tubos de PCR de 0,2 mililitros. Agregue dos microlitros del producto de PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Incluya agua doble destilada como control negativo para esta ronda de PCR. A continuación, realice ciclos térmicos de PCR utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto.