Name: Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a amplificar sitios de integración retroviral mediante PCR y secuenciación de próxima generación. Este método permite mapear ubicaciones precisas en el genoma de referencia usando células HEK293T.

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Estamos muy agradecidos a nuestros colegas Stephen Hughes y Henry Levin para el consejo de que era fundamental para establecer el protocolo de NGS para la secuenciación del sitio de integración retroviral en el laboratorio Engelman. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga AI039394 y AI052014 (a ANE) y AI060354 (Centro de la Universidad de Harvard para la Investigación del SIDA).

Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo para el análisis de los sitios de integración retroviral, de la etapa inicial de infección por el virus a través de mapeo de los patrones de distribución genómicas, se describe. Este protocolo es aplicable a cualquier retrovirus y cualquier tipo de célula infectable. Además, la tubería de ensayo es muy sensible, con el potencial para recuperar un número satisfactorio de los sitios de integración únicas de diluciones seriadas de ADN genómico equivalente a la de una infección iniciado con una MOI de 6,4 x 10 ...

La integración de ADN viral (ADNv) en el genoma de la célula huésped es un paso esencial en el ciclo de vida retroviral. La integración se lleva a cabo por la enzima integrasa viral (IN), que lleva a cabo dos procesos catalíticos diferentes que conducen a la creación de la provirus de forma estable insertado 1. EN subunidades enganchar los extremos de la ADNv lineal que se genera a través de la transcripción inversa, la formación de la intasome de orden superior con ADNv extremos se mantienen unidos por un multímero IN 2-4. EN escinde &#39;extremos de la vDNA aguas abajo de 5&#39;-CA-3 invariantes&#39; el 3 secuencias en un proceso conocido como 3&#39;-procesamiento, dejando empotrados 3 &#39;termina con grupos hidroxilo reactivos en cada vDNA terminal 5-8. El intasome se importa posteriormente en el núcleo como parte de una gran asamblea de huésped y las proteínas virales conocidas como el complejo de pre-integración (PIC) 9-11. Después de encontrarse con el ADN diana celular (tDNA), EN utiliza el vDNA 3&#39;-hidroxilo groups para escindir la parte superior tDNA y hebras de fondo de forma escalonada y al mismo tiempo se une a la vDNA a grupos fosfato tDNA 5 &#39;a través del proceso de transferencia de la cadena 12,13. Retrovirus preferencias integración de exposiciones en las escalas locales y globales. A nivel local, los sitios de integración de consenso se componen de secuencias palindrómicas tDNA débilmente conservado que se extienden a partir de entre cinco y diez pares de bases aguas arriba y aguas abajo de los sitios de inserción vDNA 14,15. A nivel mundial, los retrovirus se dirigen a las anotaciones de la cromatina específicos 16. Hay siete diferentes géneros retrovirales - alfa a través épsilon, Lenti, y spuma. Los lentivirus, que incluyen el VIH-1, a favor de la integración dentro de los cuerpos de los genes transcritos activamente 17, mientras que los gammaretroviruses integran preferentemente en sitios de inicio de la transcripción (DST) y las regiones potenciadoras activos 18-20. En agudo contraste, spumavirus está fuertemente sesgada hacia heterochromATIC regiones, tales como dominios de lámina gen asociado a los pobres 21. Las preferencias locales de base tDNA son en gran parte dictado por las redes de contactos específicos de la nucleoproteína entre IN y tDNA 13,22,23. Para los lentivirus y gammaretroviruses, en relación con la integración genómica anotaciones se debe en gran parte regulado por las interacciones entre IN y factores celulares afines 24-27. La alteración de las características específicas de la red de interacción EN-tDNA 13,22,23,28 y perturbar o re-ingeniería en el huésped interacciones de los factores 25-27,29-32 han demostrado estrategias para reorientar la integración en los niveles locales y globales, respectivamente. El poder de procedimientos de secuenciación de ADN utilizados para catalogar los sitios de integración retroviral se ha incrementado enormemente en los últimos decenios. Sitios de integración se recuperaron en el trabajo pionero de purificación laborioso y utilizando técnicas de clonación manuales para producir sólo un puñado de sitios únicos por 33,34 estudio.La combinación de la amplificación LM-PCR de los cruces de ADN LTR-huésped con la capacidad de asignar sitios de integración individuales a los genomas de los proyectos de humanos y de ratón transformadas el campo, con el número de sitios recuperados de infecciones de células de cultivo de tejidos exógeno creciente a varios cientos a miles 17 , 18. La combinación más reciente de LM-PCR con la metodología NGS ha enviado incremento exorbitante profundidad biblioteca. En concreto, la pirosecuenciación produjo en el orden de decenas de miles de sitios de integración únicas 30,35-38, mientras que las bibliotecas secuenciaron mediante el uso de la agrupación de ADN pueden producir millones de secuencias únicas 19-21,39. A continuación se describe un protocolo de LM-PCR optimizado para amplificar y secuenciar los sitios de integración retroviral utilizando NGS agrupación de ADN. El método incorpora requiere secuencias adaptadoras en los cebadores de PCR y por lo tanto directamente en las moléculas de ADN amplificados, impidiendo de ese modo el requisito de un paso adaptador de ligadura adicional antes de Sequencing 40. El oleoducto análisis bioinformático, desde el análisis de la secuencia de datos en bruto para LTR-anfitrionas cruces de ADN a la cartografía de los sitios de integración únicas de características genómicas pertinentes, también se describe en general. De acuerdo con la preferencia establecida a partir de los protocolos metodológicos previos en este campo 36,38,41-43, scripts personalizados pueden ser desarrollados para ayudar a la realización de medidas específicas en el gasoducto bioinformática. La utilidad y la sensibilidad del protocolo se ilustra con datos representativos mediante la amplificación, secuenciación y el mapeo de VIH-1 sitios de integración a partir de células de cultivo de tejidos infectados en la multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 1.0, así como una serie de titulación de este ADN diluido a través del ADN celular no infectada en 5 veces pasos para una dilución máxima de 1: 15.625 para producir el aproximado MOI equivalente de 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Medio de cultivo celular estándar, compatible con células HEK293T</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Es posible que sea necesario realizar una evaluación previa de diferentes lotes de suero para una producción viral óptima</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibióticos que se agregarán a DMEM</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Se utiliza para lavar células</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Se utiliza para separar células adherentes de placas de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>reactivo de transfección de ADN</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m Filtros</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Se utiliza para filtrar medios de cultivo celular que contienen partículas de virus</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Se utiliza para degradar el ADN plasmídico arrastrado de las existencias de virus</td></tr><tr><td>VIH-1 p24 Ensayo de captura de antígeno</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Se utiliza para cuantificar el rendimiento de la producción de virus</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tejido</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Se utiliza para purificar el ADN genómico de las células</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Con este modelo de sonicador realice dos rondas de ciclo de trabajo, 5%; intensidad, 3; ciclos por ráfaga, 200; tiempo, 80 seg</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Se recomienda el uso de agua disponible comercialmente para reducir la posibilidad de contaminación cruzada de la muestra</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purificación Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Se utiliza para purificar el ADN durante la construcción de la biblioteca</td></tr><tr><td>Kit de reparación de extremos de ADN End-It</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Se utiliza para reparar los extremos de ADN de muestras de ADN sonicadas</td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Se utiliza con dATP para fragmentos de ADN reparados de la cola A</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Trifosfato de desoxiadenosina</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonucleasa de restricción para la escisión del ADN genómico</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonucleasa de restricción para suprimir la amplificación de la secuencia ascendente del VIH-1 U5</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzima para la unión covalente de extremos de ADN</td></tr><tr><td>compatibles Oligonucleótidos</td><td>de ADN Tecnologías de ADN integradas</td><td>personalizadas</td><td>Haga que la empresa purifique los oligos. La purificación por HPLC es suficiente para los ADN< 30 nucleótidos; PAGE purifica ADNs más largos&nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Mezcla de polimerasa</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Mezcla comercial que contiene ADN polimerasa para PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (soluciones de 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Diluir los cuatro productos químicos en hielo con agua estéril para alcanzar las concentraciones intermedias de 2,5 mM cada dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Espectrofotómetro Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>para la determinación de la concentración</td></tr> <tr><td>de ADNFluorímetro Qubit Life</td><td>Technologies</td><td>Fluorímetro Qubit&reg; 3.0</td><td>utilizado para confirmar la concentración de ADN de la biblioteca del sitio de integración</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Ensayo basado en cinta para confirmar la distribución del tamaño del ADN de la biblioteca del sitio de integración</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>utilizado para NGS</td></tr></tbody></table>

amplificación, secuenciación de próxima generación, y genómica mapeo de adn retrovirales sitios de integración

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Los retrovirus presentan preferencias de integración de la firma en tanto a escala local y global. A continuación, presentamos un protocolo detallado para (1) generación de diversas bibliotecas de sitios de integración retroviral utilizando la amplificación por PCR (LM-PCR) mediada por la ligadura y la secuenciación de próxima generación (NGS), (2) el mapeo de la localización genómica de cada virus- sede de unión usando BEDTools, y (3) el análisis de los datos de relevancia estadística. El ADN genómico extraído de células infectadas se fragmenta por digestión con enzimas de restricción o por sonicación. Después del final de reparación de ADN adecuado, enlazadores de doble cadena se ligan en los extremos del ADN, y PCR semi-anidada se llevaron a cabo utilizando cebadores complementarios a tanto el extremo repetición terminal larga (LTR) del virus y el ADN enlazador se ligó. Los cebadores de la PCR llevan secuencias requeridas para la agrupación de ADN durante la NGS, negando la necesidad de la ligadura de adaptador independiente. El control de calidad (QC) se llevó a cabo para evaluar la distribución de tamaño de los fragmentos de ADN y adaptarer incorporación de ADN antes de NGS. los archivos de salida de secuencia se filtran para LTR contiene lee, y las secuencias que definen el LTR y el enlazador se recortan de distancia. secuencias de la célula huésped recortadas se asignan a un genoma de referencia utilizando Blat y se filtran por la identidad mínimamente 97% a un punto único en el genoma de referencia. sitios de integración únicas son examinadas por el nucleótido adyacente (nt) secuencia y distribución relativa de diferentes características genómicas. El uso de este protocolo, las bibliotecas del sitio de integración de alta complejidad se pueden construir a partir de ADN genómico en tres días. por lo tanto, todo el protocolo que abarca la infección viral exógena de células de cultivo de tejidos susceptibles de análisis del sitio de integración puede llevarse a cabo en aproximadamente una a dos semanas. Las aplicaciones recientes de esta tecnología se refieren a análisis longitudinal de los sitios de integración de los pacientes infectados por el VIH.

La Tabla 4 muestra los resultados de un experimento representativo para ilustrar la sensibilidad de NGS para la recuperación de los sitios de integración a partir de un cultivo de células infectadas. ADN celular no infectadas se utilizó para diluir en serie de ADN genómico a partir de una infección en la que cada célula en promedio contenía una integración 40. Las diluciones se preparan en pasos de cinco a una dilución máxima de 1: 15.625. El ADN genómico de l...

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

El objetivo general de este procedimiento es amplificar por PCR los sitios de integración retroviral a partir de ADN genómico total y secuenciar la biblioteca de ADN resultante, de modo que las ubicaciones precisas de integración puedan mapearse en un genoma de referencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en retrovirología básica y clínica mediante el análisis de la distribución de los sitios de integración en todo el genoma del huésped. La principal ventaja de esta técnica es la profundidad de secuenciación del ADN y el hecho de que muchas muestras pueden multiplexarse en una sola corrida de secuenciación.Un día antes de la transfección, siembre 3,3 × 10⁶ células HEK293T en 10 mililitros de medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado en cada una de cinco placas de 100 milímetros. Al día siguiente, utilice reactivos de transfección disponibles comercialmente o fosfato de calcio para transfectar las células con 10 microgramos de plásmido que contenga clones moleculares retrovirales de longitud completa o nueve microgramos de vectores de ronda única con envoltura truncada más un microgramo de un constructo de expresión de VSV-G. Añada la mezcla al medio celular gota a gota.Después de la transfección, incubar las células a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo celular humedecido con 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente 48 horas después, recolectar el medio celular que contiene el virus utilizando una pipeta volumétrica y pasarlo a través de un filtro de 0,45 micrones por flujo gravitatorio. A continuación, concentrar el virus mediante ultracentrifugación a 200.000 Gs durante una hora a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, elimine el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS, y resuspenda el botón vírico. Añada 20 unidades de DNasa e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Determine la concentración de p24 utilizando un kit de captura de antígeno p24 del VIH-1 según las instrucciones del fabricante.El día anterior a la infección, sembrar 3,0 × 10⁵ células HEK293T en 2,5 mililitros de DMEM FPS por pocillo en una placa de seis pocillos e incubar durante la noche en un incubador de cultivo celular. Infectar las células con una concentración final de p24 viral de 500 nanogramos por mililitro en 500 microlitros de DMEM FPS fresco. Incubar durante dos horas en un incubador de cultivo celular.Después de dos horas, agregue dos mililitros de DMEM FPS precalentado a 37 grados Celsius a cada pocillo y regrese la placa al incubador. Cuarenta y ocho horas después de la infección, retire el medio y lave las células con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Recopile las células agregando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA precalentada a 37 grados Celsius, y después de unos segundos, inspeccione visualmente los pocillos para verificar el desprendimiento celular.A continuación, agregue dos mililitros de DMEM FPS precalentado y resuspenda las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta volumétrica. Transfiera la solución a un frasco de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados que contenga 18 mililitros de DMEM FPS precalentado, y devuélvalo al incubador de cultivo de tejidos. Un mínimo de cinco días después de la infección, recoga las células como antes y resuspenda en cinco mililitros de DMEM FPS precalentado mediante pipeteo.Centrifugar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente a 2,500 Gs, luego aspirar y desechar el sobrenadante. Por último, extraer el ADN genómico del sedimento celular utilizando un kit disponible comercialmente. Eluir el ADN de la columna de intercambio iónico suministrada con 200 microlitros de Tris-HCl milimolar a pH 8,5.Después de la sonicación del ADN genómico, purifique el ADN sonicado utilizando un kit de purificación de PCR. A continuación, repare el ADN utilizando un kit de reparación de extremos. Después de la purificación del ADN como antes, agregue una cola A al ADN utilizando la enzima Klenow Exo-Minus.Alternativamente, para la fragmentación mediante digestión con endonucleasas de restricción, corte el ADN genómico con una mezcla de enzimas que generen extremos salientes 5'TA, así como una enzima incompatible como BglII que corte aguas abajo del LTR viral upstream. Corte 10 microgramos de ADN genómico en un volumen final de 100 microlitros. Incube toda la noche a 37 grados Celsius.Asegúrese de que el ADN final se purifique utilizando el kit de purificación de PCR. El conector que se utilice con el ADN sonicado debe contener un extremo 3'T sobresaliente compatible, mientras que el conector para el ADN digerido con MseI debe contener un extremo 5'TA sobresaliente compatible. Comience por hibridar 10 micromolar de las cadenas de conectores cortos y largos en 35 microlitros de tampón Tris-HCl EDTA, calentando a 90 grados Celsius y enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente en pasos de un grado Celsius por minuto.A continuación, prepare al menos cuatro reacciones de ligación paralelas por muestra de ADN genómico que contengan 1,5 micromolar de conector ligado, un microgramo de ADN fragmentado y 800 unidades de ligasa T4 de ADN en un volumen final de 50 microlitros. Realice la ligación durante la noche a 12 grados Celsius. Para las muestras preparadas por sonicación, digiera la reacción de ligación purificada con una enzima de restricción que corte aguas abajo del LTR upstream.Utilice 100 unidades de la enzima adecuada bajo las condiciones recomendadas por el fabricante durante la noche. Asegúrese de que los productos finales se purifiquen utilizando un kit de purificación de PCR. Prepare las PCR de primera ronda utilizando los reactivos mostrados aquí.Realice la PCR de primera ronda utilizando los siguientes parámetros: 94 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos, 55 grados Celsius durante 30 segundos y 68 grados Celsius durante 45 segundos. Finalice con 68 grados Celsius durante 10 minutos. Combine las reacciones de la primera ronda y purifique el ADN como antes.Luego, prepare las PCR de segunda ronda que contienen los reactivos mostrados aquí. Utilice los mismos parámetros de ciclado que para la PCR de primera ronda. Después de reunir y purificar el ADN de la reacción de segunda ronda, realice el control de calidad y la secuenciación de próxima generación, y analice los sitios de integración siguiendo las instrucciones detalladas en la parte escrita del protocolo.Los sitios de integración de bibliotecas preparadas mediante digestión con enzimas de restricción, como se muestra a la izquierda, o mediante sonicación, como se muestra a la derecha, se alinearon utilizando software de logotipo en web. Se representa cada dilución en la serie de titulación, desde el ADN puro en la parte superior de la figura hasta la dilución máxima de uno a 15 625 en la parte inferior. El grado de certeza disminuye con el aumento de la dilución del ADN de células infectadas.Esta imagen muestra el logo de secuencia para el control aleatorio emparejado de 50.000 sitios genómicos únicos. Téngase en cuenta que los sitios aleatorios alineados del conjunto de datos MRC, por el contrario, no lograron generar niveles apreciables de preferencias de bases. Una vez dominada la técnica, las bibliotecas de sitios de integración pueden prepararse a partir de ADN genómico en tres días.Por lo tanto, el mapeo de sitios de integración, desde la infección inicial hasta la finalización de los análisis bioinformáticos, puede completarse en aproximadamente dos semanas. Tras seguir este procedimiento, se pueden catalogar miles o incluso millones de sitios únicos de integración retroviral, y se pueden realizar diversos análisis para cuantificar las asociaciones entre los sitios de inserción y las anotaciones genómicas.

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