Name: Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a amplificar sitios de integración retroviral mediante PCR y secuenciación de próxima generación. Este método permite mapear ubicaciones precisas en el genoma de referencia usando células HEK293T.

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Estamos muy agradecidos a nuestros colegas Stephen Hughes y Henry Levin para el consejo de que era fundamental para establecer el protocolo de NGS para la secuenciación del sitio de integración retroviral en el laboratorio Engelman. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga AI039394 y AI052014 (a ANE) y AI060354 (Centro de la Universidad de Harvard para la Investigación del SIDA).

Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo para el análisis de los sitios de integración retroviral, de la etapa inicial de infección por el virus a través de mapeo de los patrones de distribución genómicas, se describe. Este protocolo es aplicable a cualquier retrovirus y cualquier tipo de célula infectable. Además, la tubería de ensayo es muy sensible, con el potencial para recuperar un número satisfactorio de los sitios de integración únicas de diluciones seriadas de ADN genómico equivalente a la de una infección iniciado con una MOI de 6,4 x 10 ...

La integración de ADN viral (ADNv) en el genoma de la célula huésped es un paso esencial en el ciclo de vida retroviral. La integración se lleva a cabo por la enzima integrasa viral (IN), que lleva a cabo dos procesos catalíticos diferentes que conducen a la creación de la provirus de forma estable insertado 1. EN subunidades enganchar los extremos de la ADNv lineal que se genera a través de la transcripción inversa, la formación de la intasome de orden superior con ADNv extremos se mantienen unidos por un multímero IN 2-4. EN escinde &#39;extremos de la vDNA aguas abajo de 5&#39;-CA-3 invariantes&#39; el 3 secuencias en un proceso conocido como 3&#39;-procesamiento, dejando empotrados 3 &#39;termina con grupos hidroxilo reactivos en cada vDNA terminal 5-8. El intasome se importa posteriormente en el núcleo como parte de una gran asamblea de huésped y las proteínas virales conocidas como el complejo de pre-integración (PIC) 9-11. Después de encontrarse con el ADN diana celular (tDNA), EN utiliza el vDNA 3&#39;-hidroxilo groups para escindir la parte superior tDNA y hebras de fondo de forma escalonada y al mismo tiempo se une a la vDNA a grupos fosfato tDNA 5 &#39;a través del proceso de transferencia de la cadena 12,13. Retrovirus preferencias integración de exposiciones en las escalas locales y globales. A nivel local, los sitios de integración de consenso se componen de secuencias palindrómicas tDNA débilmente conservado que se extienden a partir de entre cinco y diez pares de bases aguas arriba y aguas abajo de los sitios de inserción vDNA 14,15. A nivel mundial, los retrovirus se dirigen a las anotaciones de la cromatina específicos 16. Hay siete diferentes géneros retrovirales - alfa a través épsilon, Lenti, y spuma. Los lentivirus, que incluyen el VIH-1, a favor de la integración dentro de los cuerpos de los genes transcritos activamente 17, mientras que los gammaretroviruses integran preferentemente en sitios de inicio de la transcripción (DST) y las regiones potenciadoras activos 18-20. En agudo contraste, spumavirus está fuertemente sesgada hacia heterochromATIC regiones, tales como dominios de lámina gen asociado a los pobres 21. Las preferencias locales de base tDNA son en gran parte dictado por las redes de contactos específicos de la nucleoproteína entre IN y tDNA 13,22,23. Para los lentivirus y gammaretroviruses, en relación con la integración genómica anotaciones se debe en gran parte regulado por las interacciones entre IN y factores celulares afines 24-27. La alteración de las características específicas de la red de interacción EN-tDNA 13,22,23,28 y perturbar o re-ingeniería en el huésped interacciones de los factores 25-27,29-32 han demostrado estrategias para reorientar la integración en los niveles locales y globales, respectivamente. El poder de procedimientos de secuenciación de ADN utilizados para catalogar los sitios de integración retroviral se ha incrementado enormemente en los últimos decenios. Sitios de integración se recuperaron en el trabajo pionero de purificación laborioso y utilizando técnicas de clonación manuales para producir sólo un puñado de sitios únicos por 33,34 estudio.La combinación de la amplificación LM-PCR de los cruces de ADN LTR-huésped con la capacidad de asignar sitios de integración individuales a los genomas de los proyectos de humanos y de ratón transformadas el campo, con el número de sitios recuperados de infecciones de células de cultivo de tejidos exógeno creciente a varios cientos a miles 17 , 18. La combinación más reciente de LM-PCR con la metodología NGS ha enviado incremento exorbitante profundidad biblioteca. En concreto, la pirosecuenciación produjo en el orden de decenas de miles de sitios de integración únicas 30,35-38, mientras que las bibliotecas secuenciaron mediante el uso de la agrupación de ADN pueden producir millones de secuencias únicas 19-21,39. A continuación se describe un protocolo de LM-PCR optimizado para amplificar y secuenciar los sitios de integración retroviral utilizando NGS agrupación de ADN. El método incorpora requiere secuencias adaptadoras en los cebadores de PCR y por lo tanto directamente en las moléculas de ADN amplificados, impidiendo de ese modo el requisito de un paso adaptador de ligadura adicional antes de Sequencing 40. El oleoducto análisis bioinformático, desde el análisis de la secuencia de datos en bruto para LTR-anfitrionas cruces de ADN a la cartografía de los sitios de integración únicas de características genómicas pertinentes, también se describe en general. De acuerdo con la preferencia establecida a partir de los protocolos metodológicos previos en este campo 36,38,41-43, scripts personalizados pueden ser desarrollados para ayudar a la realización de medidas específicas en el gasoducto bioinformática. La utilidad y la sensibilidad del protocolo se ilustra con datos representativos mediante la amplificación, secuenciación y el mapeo de VIH-1 sitios de integración a partir de células de cultivo de tejidos infectados en la multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 1.0, así como una serie de titulación de este ADN diluido a través del ADN celular no infectada en 5 veces pasos para una dilución máxima de 1: 15.625 para producir el aproximado MOI equivalente de 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Medio de cultivo celular estándar, compatible con células HEK293T</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Es posible que sea necesario realizar una evaluación previa de diferentes lotes de suero para una producción viral óptima</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibióticos que se agregarán a DMEM</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Se utiliza para lavar células</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Se utiliza para separar células adherentes de placas de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>reactivo de transfección de ADN</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m Filtros</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Se utiliza para filtrar medios de cultivo celular que contienen partículas de virus</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Se utiliza para degradar el ADN plasmídico arrastrado de las existencias de virus</td></tr><tr><td>VIH-1 p24 Ensayo de captura de antígeno</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Se utiliza para cuantificar el rendimiento de la producción de virus</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tejido</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Se utiliza para purificar el ADN genómico de las células</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Con este modelo de sonicador realice dos rondas de ciclo de trabajo, 5%; intensidad, 3; ciclos por ráfaga, 200; tiempo, 80 seg</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Se recomienda el uso de agua disponible comercialmente para reducir la posibilidad de contaminación cruzada de la muestra</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purificación Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Se utiliza para purificar el ADN durante la construcción de la biblioteca</td></tr><tr><td>Kit de reparación de extremos de ADN End-It</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Se utiliza para reparar los extremos de ADN de muestras de ADN sonicadas</td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Se utiliza con dATP para fragmentos de ADN reparados de la cola A</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Trifosfato de desoxiadenosina</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonucleasa de restricción para la escisión del ADN genómico</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonucleasa de restricción para suprimir la amplificación de la secuencia ascendente del VIH-1 U5</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzima para la unión covalente de extremos de ADN</td></tr><tr><td>compatibles Oligonucleótidos</td><td>de ADN Tecnologías de ADN integradas</td><td>personalizadas</td><td>Haga que la empresa purifique los oligos. La purificación por HPLC es suficiente para los ADN< 30 nucleótidos; PAGE purifica ADNs más largos&nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Mezcla de polimerasa</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Mezcla comercial que contiene ADN polimerasa para PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (soluciones de 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Diluir los cuatro productos químicos en hielo con agua estéril para alcanzar las concentraciones intermedias de 2,5 mM cada dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Espectrofotómetro Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>para la determinación de la concentración</td></tr> <tr><td>de ADNFluorímetro Qubit Life</td><td>Technologies</td><td>Fluorímetro Qubit&reg; 3.0</td><td>utilizado para confirmar la concentración de ADN de la biblioteca del sitio de integración</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Ensayo basado en cinta para confirmar la distribución del tamaño del ADN de la biblioteca del sitio de integración</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>utilizado para NGS</td></tr></tbody></table>

amplificación, secuenciación de próxima generación, y genómica mapeo de adn retrovirales sitios de integración

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Los retrovirus presentan preferencias de integración de la firma en tanto a escala local y global. A continuación, presentamos un protocolo detallado para (1) generación de diversas bibliotecas de sitios de integración retroviral utilizando la amplificación por PCR (LM-PCR) mediada por la ligadura y la secuenciación de próxima generación (NGS), (2) el mapeo de la localización genómica de cada virus- sede de unión usando BEDTools, y (3) el análisis de los datos de relevancia estadística. El ADN genómico extraído de células infectadas se fragmenta por digestión con enzimas de restricción o por sonicación. Después del final de reparación de ADN adecuado, enlazadores de doble cadena se ligan en los extremos del ADN, y PCR semi-anidada se llevaron a cabo utilizando cebadores complementarios a tanto el extremo repetición terminal larga (LTR) del virus y el ADN enlazador se ligó. Los cebadores de la PCR llevan secuencias requeridas para la agrupación de ADN durante la NGS, negando la necesidad de la ligadura de adaptador independiente. El control de calidad (QC) se llevó a cabo para evaluar la distribución de tamaño de los fragmentos de ADN y adaptarer incorporación de ADN antes de NGS. los archivos de salida de secuencia se filtran para LTR contiene lee, y las secuencias que definen el LTR y el enlazador se recortan de distancia. secuencias de la célula huésped recortadas se asignan a un genoma de referencia utilizando Blat y se filtran por la identidad mínimamente 97% a un punto único en el genoma de referencia. sitios de integración únicas son examinadas por el nucleótido adyacente (nt) secuencia y distribución relativa de diferentes características genómicas. El uso de este protocolo, las bibliotecas del sitio de integración de alta complejidad se pueden construir a partir de ADN genómico en tres días. por lo tanto, todo el protocolo que abarca la infección viral exógena de células de cultivo de tejidos susceptibles de análisis del sitio de integración puede llevarse a cabo en aproximadamente una a dos semanas. Las aplicaciones recientes de esta tecnología se refieren a análisis longitudinal de los sitios de integración de los pacientes infectados por el VIH.

La Tabla 4 muestra los resultados de un experimento representativo para ilustrar la sensibilidad de NGS para la recuperación de los sitios de integración a partir de un cultivo de células infectadas. ADN celular no infectadas se utilizó para diluir en serie de ADN genómico a partir de una infección en la que cada célula en promedio contenía una integración 40. Las diluciones se preparan en pasos de cinco a una dilución máxima de 1: 15.625. El ADN genómico de l...

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

El objetivo general de este procedimiento es amplificar por PCR los sitios de integración retroviral a partir de ADN genómico total y secuenciar la biblioteca de ADN resultante, de modo que las ubicaciones precisas de integración puedan mapearse en un genoma de referencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en retrovirología básica y clínica mediante el análisis de la distribución de los sitios de integración en todo el genoma del huésped. La principal ventaja de esta técnica es la profundidad de secuenciación del ADN y el hecho de que muchas muestras pueden multiplexarse en una sola corrida de secuenciación.Un día antes de la transfección, siembre 3,3 × 10⁶ células HEK293T en 10 mililitros de medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado en cada una de cinco placas de 100 milímetros. Al día siguiente, utilice reactivos de transfección disponibles comercialmente o fosfato de calcio para transfectar las células con 10 microgramos de plásmido que contenga clones moleculares retrovirales de longitud completa o nueve microgramos de vectores de ronda única con envoltura truncada más un microgramo de un constructo de expresión de VSV-G. Añada la mezcla al medio ce

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Investigación

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Biología

Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc...

Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

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Aprende a amplificar sitios de integración retroviral mediante PCR y secuenciación de próxima generación. Este método permite mapear ubicaciones precisas en el genoma de referencia usando células HEK293T.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

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