Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

El objetivo general de este procedimiento es amplificar por PCR los sitios de integración retroviral a partir de ADN genómico total y secuenciar la biblioteca de ADN resultante, de modo que las ubicaciones precisas de integración puedan mapearse en un genoma de referencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en retrovirología básica y clínica mediante el análisis de la distribución de los sitios de integración en todo el genoma del huésped. La principal ventaja de esta técnica es la profundidad de secuenciación del ADN y el hecho de que muchas muestras pueden multiplexarse en una sola corrida de secuenciación.

Un día antes de la transfección, siembre 3,3 × 10⁶ células HEK293T en 10 mililitros de medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado en cada una de cinco placas de 100 milímetros. Al día siguiente, utilice reactivos de transfección disponibles comercialmente o fosfato de calcio para transfectar las células con 10 microgramos de plásmido que contenga clones moleculares retrovirales de longitud completa o nueve microgramos de vectores de ronda única con envoltura truncada más un microgramo de un constructo de expresión de VSV-G. Añada la mezcla al medio celular gota a gota.

Después de la transfección, incubar las células a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo celular humedecido con 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente 48 horas después, recolectar el medio celular que contiene el virus utilizando una pipeta volumétrica y pasarlo a través de un filtro de 0,45 micrones por flujo gravitatorio. A continuación, concentrar el virus mediante ultracentrifugación a 200.000 Gs durante una hora a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, elimine el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS, y resuspenda el botón vírico. Añada 20 unidades de DNasa e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Determine la concentración de p24 utilizando un kit de captura de antígeno p24 del VIH-1 según las instrucciones del fabricante.

El día anterior a la infección, sembrar 3,0 × 10⁵ células HEK293T en 2,5 mililitros de DMEM FPS por pocillo en una placa de seis pocillos e incubar durante la noche en un incubador de cultivo celular. Infectar las células con una concentración final de p24 viral de 500 nanogramos por mililitro en 500 microlitros de DMEM FPS fresco. Incubar durante dos horas en un incubador de cultivo celular.

Después de dos horas, agregue dos mililitros de DMEM FPS precalentado a 37 grados Celsius a cada pocillo y regrese la placa al incubador. Cuarenta y ocho horas después de la infección, retire el medio y lave las células con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Recopile las células agregando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA precalentada a 37 grados Celsius, y después de unos segundos, inspeccione visualmente los pocillos para verificar el desprendimiento celular.

A continuación, agregue dos mililitros de DMEM FPS precalentado y resuspenda las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta volumétrica. Transfiera la solución a un frasco de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados que contenga 18 mililitros de DMEM FPS precalentado, y devuélvalo al incubador de cultivo de tejidos. Un mínimo de cinco días después de la infección, recoga las células como antes y resuspenda en cinco mililitros de DMEM FPS precalentado mediante pipeteo.

Centrifugar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente a 2,500 Gs, luego aspirar y desechar el sobrenadante. Por último, extraer el ADN genómico del sedimento celular utilizando un kit disponible comercialmente. Eluir el ADN de la columna de intercambio iónico suministrada con 200 microlitros de Tris-HCl milimolar a pH 8,5.

Después de la sonicación del ADN genómico, purifique el ADN sonicado utilizando un kit de purificación de PCR. A continuación, repare el ADN utilizando un kit de reparación de extremos. Después de la purificación del ADN como antes, agregue una cola A al ADN utilizando la enzima Klenow Exo-Minus.

Alternativamente, para la fragmentación mediante digestión con endonucleasas de restricción, corte el ADN genómico con una mezcla de enzimas que generen extremos salientes 5'TA, así como una enzima incompatible como BglII que corte aguas abajo del LTR viral upstream. Corte 10 microgramos de ADN genómico en un volumen final de 100 microlitros. Incube toda la noche a 37 grados Celsius.

Asegúrese de que el ADN final se purifique utilizando el kit de purificación de PCR. El conector que se utilice con el ADN sonicado debe contener un extremo 3'T sobresaliente compatible, mientras que el conector para el ADN digerido con MseI debe contener un extremo 5'TA sobresaliente compatible. Comience por hibridar 10 micromolar de las cadenas de conectores cortos y largos en 35 microlitros de tampón Tris-HCl EDTA, calentando a 90 grados Celsius y enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente en pasos de un grado Celsius por minuto.

A continuación, prepare al menos cuatro reacciones de ligación paralelas por muestra de ADN genómico que contengan 1,5 micromolar de conector ligado, un microgramo de ADN fragmentado y 800 unidades de ligasa T4 de ADN en un volumen final de 50 microlitros. Realice la ligación durante la noche a 12 grados Celsius. Para las muestras preparadas por sonicación, digiera la reacción de ligación purificada con una enzima de restricción que corte aguas abajo del LTR upstream.

Utilice 100 unidades de la enzima adecuada bajo las condiciones recomendadas por el fabricante durante la noche. Asegúrese de que los productos finales se purifiquen utilizando un kit de purificación de PCR. Prepare las PCR de primera ronda utilizando los reactivos mostrados aquí.

Realice la PCR de primera ronda utilizando los siguientes parámetros: 94 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos, 55 grados Celsius durante 30 segundos y 68 grados Celsius durante 45 segundos. Finalice con 68 grados Celsius durante 10 minutos. Combine las reacciones de la primera ronda y purifique el ADN como antes.

Luego, prepare las PCR de segunda ronda que contienen los reactivos mostrados aquí. Utilice los mismos parámetros de ciclado que para la PCR de primera ronda. Después de reunir y purificar el ADN de la reacción de segunda ronda, realice el control de calidad y la secuenciación de próxima generación, y analice los sitios de integración siguiendo las instrucciones detalladas en la parte escrita del protocolo.

Los sitios de integración de bibliotecas preparadas mediante digestión con enzimas de restricción, como se muestra a la izquierda, o mediante sonicación, como se muestra a la derecha, se alinearon utilizando software de logotipo en web. Se representa cada dilución en la serie de titulación, desde el ADN puro en la parte superior de la figura hasta la dilución máxima de uno a 15 625 en la parte inferior. El grado de certeza disminuye con el aumento de la dilución del ADN de células infectadas.

Esta imagen muestra el logo de secuencia para el control aleatorio emparejado de 50.000 sitios genómicos únicos. Téngase en cuenta que los sitios aleatorios alineados del conjunto de datos MRC, por el contrario, no lograron generar niveles apreciables de preferencias de bases. Una vez dominada la técnica, las bibliotecas de sitios de integración pueden prepararse a partir de ADN genómico en tres días.

Por lo tanto, el mapeo de sitios de integración, desde la infección inicial hasta la finalización de los análisis bioinformáticos, puede completarse en aproximadamente dos semanas. Tras seguir este procedimiento, se pueden catalogar miles o incluso millones de sitios únicos de integración retroviral, y se pueden realizar diversos análisis para cuantificar las asociaciones entre los sitios de inserción y las anotaciones genómicas.