Tecnología de interferometría de biocapas para detectar interacciones entre ligando y analito

Para detectar interacciones ligando-analito mediante interferometría de biocapa, BLI, comience con un biosensor de fibra óptica hidratado fijado en un soporte de instrumento BLI, configurado en el programa deseado.

La punta del biosensor está recubierta con una capa biocompatible inmovilizada con grupos de níquel-ácido nitrilotriacético, Ni-NTA. Sumerja la punta del biosensor en tampón.

El instrumento emite luz blanca hacia el biosensor, que se refleja desde dos interfaces: la capa de referencia interna u óptica y la capa biocompatible. Los haces reflejados interfieren constructiva o destructivamente en diferentes longitudes de onda de luz. Un fotodetector detecta el patrón de interferencia resultante.

Después de la medición de la respuesta interferométrica inicial, agregue una solución de ligando marcada con histidina. Las etiquetas de histidina se unen a cationes de níquel en el biosensor, inmovilizando ligandos en la punta.

Después de la asociación, la luz blanca emitida se refleja desde la capa óptica y la capa biocompatible se inmoviliza con ligandos con un mayor grosor óptico en la punta. Esto aumenta la distancia entre las capas reflectantes, lo que provoca un cambio en el patrón de interferencia y un cambio en la longitud de onda.

Lave la punta, eliminando los ligandos no unidos. Incubar con solución de analito objetivo. El analito se une al ligando, aumentando aún más el grosor óptico en la punta, lo que provoca un mayor cambio de longitud de onda.

Coloque la punta del biosensor en el tampón. Registre el cambio de longitud de onda durante la disociación del analito del ligando inmovilizado en la punta.

El monitoreo del cambio en el cambio de longitud de onda a lo largo del tiempo facilita el estudio de las interacciones moleculares entre ligandos y analitos.

Encienda la máquina BLItz. Asegúrese de que la máquina esté conectada a la computadora a través de un puerto de salida de datos USB en la parte posterior de la máquina.

En la computadora, abra el software asociado y haga clic en "Cinética avanzada" en el lado izquierdo de la pantalla. En el software, escriba toda la información apropiada sobre el experimento en cada encabezado respectivo. Haga clic en "Tipo de biosensor" y elija "Ni-NTA" en el menú desplegable. La duración de cada paso se puede cambiar de Predeterminado según sea necesario. Para obtener resultados óptimos, utilice un mínimo de 30 segundos para la línea de base inicial y la línea de base y 120 segundos para la asociación y la disociación.

Retire el biosensor de níquel-NTA hidratado del tubo de PCR y fíjelo al soporte del biosensor de la máquina, deslizando la parte ancha del biosensor sobre el soporte.

Coloque un tubo de microcentrífuga negro de 0,5 mililitros en el soporte del tubo de la máquina y pipetee 400 microlitros de tampón BLI en él. Cierre la tapa de la máquina de modo que la punta del biosensor se sumerja en el tampón del tubo de microcentrífuga. Haga clic en "Siguiente" en el software para comenzar a registrar la línea de base inicial.

Una vez finalizado el registro del paso inicial de la línea de base, abra la tapa de la máquina. Mueva el control deslizante hacia la derecha. Pipetee 4 microlitros de un ligando dializado con etiquetas His en el soporte de la gota y cierre la tapa de la máquina, que comenzará a registrar automáticamente el paso de carga.

Una vez que el paso de carga haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina. Mueva el control deslizante hacia la izquierda, de modo que el soporte del tubo vuelva a situarse frente a la flecha negra. Cierre la tapa de la máquina y asegúrese de que la punta del biosensor esté sumergida en el tampón BLI del tubo en el soporte del tubo. La máquina y el software comenzarán a registrar automáticamente el paso de referencia.

Una vez que el paso de línea base haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina. Retire el soporte de gotas y límpielo pipeteando cualquier proteína y enjuagándolo con agua doblemente desionizada un total de cinco veces. Use una toallita de papel para limpiar la superficie del soporte de gotas después del último lavado. Vuelva a colocar el soporte de caída en la máquina. Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha de modo que el soporte de la gota quede situado una vez más delante de la flecha negra.

Pipetee 4 microlitros de un analito dializado en el soporte de gotas y cierre la tapa de la máquina, que comenzará a registrar automáticamente el paso de asociación. Una vez finalizado el registro del paso de asociación, abra la tapa de la máquina. Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha de modo que el soporte del tubo quede situado una vez más frente a la flecha negra y cierre la tapa de la máquina, que comenzará a registrar automáticamente el paso de disociación.