Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

El objetivo general del siguiente experimento es medir la cinética de las proteínas, las interacciones de las proteínas y los efectos alostéricos de los ligandos pequeños en esas interacciones utilizando la interferometría de biocapas, BLI. Esto se consigue preparando una de las proteínas con biotina específica e inmovilizándola en la superficie del estreptococo. Biosensores recubiertos de Aden en paralelo.

Como segundo paso, la proteína unida al sensor se expone a un tampón que contiene su compañero de unión, y la unión se mide en tiempo real por su efecto sobre la interferencia óptica en la superficie del sensor. A continuación, cada sensor se transfiere al tampón sin el socio de unión para medir la disociación en tiempo real de la proteína. Complejos proteicos.

Los resultados obtenidos permiten determinar las constantes de velocidad cinética de unión y disociación de las proteínas que interactúan y, por lo tanto, su afinidad de unión. Otros resultados muestran que BLI puede detectar los efectos de ligandos pequeños en la tasa de disociación del complejo proteico-proteico. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la resonancia con plasma de superficie, es que el BLI no es demasiado sensible a los cambios en el índice de refracción.

Por lo tanto, los pasos de unión y asociación pueden incluir cambios en ligandos pequeños para probar sus efectos en las interacciones proteína-proteína en tiempo real, sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la cinética de la interacción proteína-proteína. También se puede aplicar a diferentes combinaciones, como la unión de proteínas a ADN o ARN inmovilizado o la unión de liposomas a una proteína inmovilizada. Comience este experimento configurando el instrumento BLI como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, configure el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione nuevo experimento cinético en la pestaña del asistente de experimentos. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que deben definirse en la pestaña uno.

Defina las columnas que se van a utilizar. En la placa de muestra de 96 pocillos. Asigne columnas para que contengan el tampón, la proteína que se va a inmovilizar o el compañero de unión.

Para cada asociación, introduzca la concentración de socio vinculante que se utilizará. En la pestaña dos, defina todos los pasos necesarios para el ensayo. Estos incluyen la asociación de carga de línea base y la disociación del socio de unión.

Los pasos de ensayo individuales se vinculan con columnas de pocillos en la placa de muestra seleccionando el paso de ensayo y luego haciendo doble clic en la columna respectiva. Esto programa los sensores para que se muevan de una columna de pozos a la siguiente. Durante el ensayo, comience con un breve paso de referencia vinculado a la primera columna de pocillos con tampón de ensayo para establecer las señales BLI iniciales en la placa de 96 pocillos.

A continuación, vincule la etapa de carga a los pocillos que contendrán la proteína biotinilada. Utilice la función de umbral para lograr un nivel predeterminado de enlace. Establezca la opción de umbral para que todos los sensores se muevan a la siguiente columna de pozos.

Cuando cualquiera de los sensores alcance el umbral, incluya otro paso de referencia en el tampón para eliminar las proteínas biotiniladas no inmovilizadas de los sensores y establezca nuevas señales de referencia estables para los ensayos básicos para determinar las constantes de tasa de unión y disociación globales, incluya un paso de referencia adicional con sensores en una nueva columna de pocillos tampón antes de la asociación. Paso a continuación, vincule la asociación. Paso a la columna de pocillos que contienen concentraciones variables del socio de unión.

Ajuste el tiempo de paso para que al menos una concentración de saturación del socio de unión alcance la señal de enlace de equilibrio. Para el paso de disociación, designe los sensores para que regresen a la columna cuatro, los mismos pozos de amortiguación que se usaron para la línea de base adicional antes de la asociación. Los tiempos para los pasos de asociación y disociación se pueden ajustar durante el experimento si las tasas son más lentas o más rápidas de lo previsto.

En la pestaña tres, indique las ubicaciones en la bandeja de sensores que contendrán sensores prehumedecidos para el ensayo. La pestaña cuatro permite una revisión gráfica del programa. En la pestaña cinco, ingrese los detalles necesarios, incluida la ubicación de los archivos de datos y la temperatura deseada.

Para el experimento. Humedece previamente los sensores recubiertos de estreptavidina durante al menos 10 minutos. Para eliminar su capa protectora de sacarosa, retire el sensor que contiene el bastidor de la bandeja del sensor e inserte una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación de la bandeja.

Para la columna de sensores que se va a utilizar, agregue 200 microlitros de tampón de ensayo por pocillo. En esa columna de la placa de 96 pocillos, regrese el bastidor de sensores a la bandeja en la orientación correcta asignada durante la programación, llene los pocillos de la placa de muestra con tampón de ensayo o las diluciones de proteínas adecuadas. Evite introducir burbujas ya que pueden causar ruido en la señal óptica.

Incluya uno o más pocillos de referencia que omitan la proteína biotinilada o el socio de unión. Abra la puerta del instrumento y observe la salida de luz del brazo del sensor. Inserte la bandeja del sensor en el escenario con las lengüetas de las bandejas insertadas en las ranuras del escenario.

Inserte la placa de muestra en el soporte de la placa. Asegúrese de que la placa esté asentada plana y en la orientación correcta como se indica en el soporte de la placa. Cierre la puerta e inicie el ensayo desde el programa de adquisición de datos.

Si los sensores aún requieren humectación previa, seleccione la opción para retrasar el inicio del experimento. Finalmente, una vez que se haya completado toda la preparación de la muestra y tanto la placa de muestra como la bandeja del sensor estén cargadas en el instrumento, haga clic en el botón Ir para ejecutar el ensayo. Una vez ejecutado el ensayo, abra el software de análisis de datos y cargue la carpeta que contiene los datos.

Haga clic en la pestaña de procesamiento para ver un menú de procesamiento paso a paso y los datos cinéticos sin procesar con cada sensor asignado a un color diferente en la selección de datos. Haga clic en el botón de selección de sensor en el mapa de placa de muestra. Designe los pozos para uno o dos sensores de control como pozos de referencia en el menú de procesamiento.

Marque la casilla de sustracción y seleccione pozos de referencia para restar la señal de referencia de todas las demás señales de los sensores. Alinee todos los seguimientos a Y igual a cero mediante el paso de alinear eje y. A continuación, seleccione línea base como paso de alineación para el intervalo de tiempo.

Introduzca los últimos 10 segundos de esa línea de base. Al hacer clic en ese paso de línea base, se mostrará la alineación. A continuación, marque la casilla de corrección entre pasos para minimizar los cambios de señal entre los pasos de asociación y disociación.

Seleccione una línea para la línea base o la disociación. En la mayoría de los casos, seleccione la función de filtrado KY gole y haga clic en datos de proceso para proceder a inspeccionar visualmente los datos finales del proceso en el panel inferior derecho. Para analizar los datos, haga clic en la pestaña de análisis en Análisis de datos para el paso a analizar, elija asociación y disociación.

Para el modelo, seleccione uno a uno para el ajuste Elija global. Para agrupar por color seleccionado, seleccione r max desvinculado por sensor para permitir el ajuste independiente de la respuesta de señal máxima al saturar la unión de la pareja a la proteína inmovilizada. Por último, haga clic en ajustar curvas para iniciar el análisis de regresión no lineal.

Examine los resultados del ajuste, que incluyen la superposición de curvas de regresión con trazas de datos de sensores, gráficos de residuos de ajuste y una tabla con valores de parámetros y estadísticas determinados. Aquí se muestra la cinética BLI de unión y disociación en tiempo real. Este experimento se inició con un paso de referencia de 10 minutos, ya que los sensores se habían humedecido previamente, solo brevemente, luego se cargó épsilon biotinilado en los sensores.

No se produjo ninguna disociación detectable de épsilon a lo largo de todos los pasos restantes, como se ve en la curva de referencia, a la que no se le añadió ningún socio de unión. Un segundo sensor de referencia estaba desprovisto de una proteína movilizada y mostraba una baja unión inespecífica del socio de unión. Se utilizaron varias concentraciones de F1 menos épsilon en el paso de asociación para los sensores de la A a la F con el fin de ajustar los resultados globalmente y obtener los mejores valores para la constante de tasa de asociación a la constante de tasa de asociación y los resultados de la constante de disociación de equilibrio KD, produciendo las trazas de datos azules.

En este caso, la traza del sensor de referencia se restó de las trazas de la muestra para corregir la unión no específica del socio de unión y la deriva de la señal del sistema. En la etapa de análisis de datos, todas las curvas se ajustaron globalmente con un modelo uno a uno, uno a uno. El ajuste global supone la disociación completa del socio de unión.

Aquí se muestra un experimento diferente en el que la enzima se unió a un sensor épsilon inmovilizado en presencia de un milimolar, A-T-P-A-D-T-A. Esto predispone a la mayoría de los complejos épsilon F1 a asumir la confirmación no inhibitoria, que se disocia fácilmente y luego los sensores se trasladaron a pozos de disociación que contienen tampón de ensayo con diferentes ligandos. Esto demuestra los efectos de diferentes ligandos en la confirmación de épsilon.

Por ejemplo, la exposición al magnesio A, GP y fosfato ralentizó drásticamente la disociación neta, lo que indica que el épsilon cambió la confirmación al estado inhibidor estrechamente unido. Al configurar por primera vez los ensayos BLI, es importante incluir controles para probar la unión no específica de la proteína a los sensores y si la unión no específica varía significativamente con las concentraciones de proteína que se van a utilizar. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, programar y analizar ensayos BLI para medir la cinética de las interacciones entre proteínas y apreciarlo.

BLI permite una prueba directa de los efectos de los ligandos pequeños en las interacciones proteína-proteína.