Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

El objetivo general del siguiente experimento es medir la cinética de las proteínas, las interacciones entre proteínas y los efectos alostéricos de ligandos pequeños sobre dichas interacciones utilizando interferometría de capa biológica, BLI. Esto se logra preparando una de las proteínas con biotina específica e inmovilizándola sobre la superficie de biosensores recubiertos con estreptavidina en paralelo.

Como segundo paso, se expone la proteína unida al sensor a un tampón que contiene su pareja de unión, y se mide la unión en tiempo real mediante su efecto sobre la interferencia óptica en la superficie del sensor. A continuación, cada sensor se transfiere a un tampón sin la pareja de unión para medir la disociación en tiempo real de la proteína. Complejos proteicos.

Los resultados obtenidos permiten la determinación de las constantes cinéticas de velocidad para la unión y disociación de las proteínas que interactúan, y por tanto, su afinidad de unión. Otros resultados muestran que la interferometría de capa biológica (BLI) puede detectar los efectos de ligandos pequeños sobre la velocidad de disociación del complejo proteína-proteína. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la resonancia de plasmón de superficie, es que la BLI no es excesivamente sensible a los cambios en el índice de refracción.

Por lo tanto, los pasos de unión y asociación pueden incluir cambios en ligandos pequeños para probar sus efectos sobre las interacciones proteína-proteína en tiempo real. No obstante, este método puede proporcionar información sobre la cinética de la interacción proteína-proteína. También puede aplicarse a diferentes combinaciones, como la unión de proteínas a ADN o ARN inmovilizados, o la unión de liposomas a una proteína inmovilizada. Comience este experimento configurando el instrumento de ILB según se describe en el protocolo escrito.

Luego configure el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione un nuevo experimento de cinética en la pestaña del asistente de experimentos. Esto muestra un menú con pestañas que contiene todos los pasos que deben definirse en la pestaña uno.

Defina las columnas que se utilizarán en la placa de muestras de 96 pocillos. Asigne columnas para contener tampón, la proteína que se inmovilizará o el compañero de unión.

Para cada asociación, introduciremos la concentración del compañero de unión que se utilizará. En la pestaña dos, defina todos los pasos necesarios para el ensayo. Estos incluyen la carga de la línea base, asociación y disociación del compañero de unión.

Los pasos individuales del ensayo se vinculan con columnas de pocillos en la placa de muestra seleccionando el paso del ensayo y luego haciendo doble clic en la columna respectiva. Esto programa a los sensores para que se muevan de una columna de pocillos a la siguiente. Durante el ensayo, comience con un breve paso de línea base vinculado a la primera columna de pocillos con tampón de ensayo para establecer las señales iniciales de BLI en la placa de 96 pocillos.

Luego, vincule el paso de carga a los pocillos que contendrán la proteína biotinilada. Utilice la función de umbral para alcanzar un nivel predeterminado de unión. Configure la opción de umbral para que todos los sensores pasen a la siguiente columna de pocillos.

Cuando cualquiera de los sensores alcance el umbral, incluya un paso adicional de línea base en tampón para lavar las proteínas biotiniladas no inmovilizadas de los sensores y establecer nuevas señales estables de línea base. Para ensayos básicos destinados a determinar las constantes globales de velocidad de unión y disociación, incluya un paso adicional de línea base con los sensores en una nueva columna de pozos con tampón antes de la fase de asociación. A continuación, pase al paso de asociación. Pase a la columna de pozos que contiene concentraciones variables del compañero de unión.

Ajuste el tiempo del paso para que al menos una concentración saturante del compañero de unión alcance la señal de equilibrio de unión. Para el paso de disociación, designe los sensores para que regresen a la columna cuatro, los mismos pozos de tampón utilizados para la línea base adicional antes de la asociación. Los tiempos de los pasos de asociación y disociación pueden ajustarse durante el experimento si las velocidades son más lentas o más rápidas de lo previsto.

En la pestaña tres, indique las ubicaciones en la bandeja del sensor que contendrán sensores previamente humedecidos para el ensayo. La pestaña cuatro permite la revisión gráfica del programa. En la pestaña cinco, ingrese los detalles necesarios, incluida la ubicación de los archivos de datos y la temperatura deseada.

Para el experimento. Humedezca previamente los sensores recubiertos con estreptavidina durante al menos 10 minutos. Para eliminar su recubrimiento protector de sacarosa, retire el bastidor que contiene los sensores de la bandeja de sensores e inserte una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja, deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación de la bandeja.

Para la columna de sensores que se utilizará, añada 200 microlitros de tampón de ensayo por pocillo. En esa columna de la placa de 96 pocillos, devuelva el soporte de sensores a la bandeja en la orientación correcta asignada durante la programación. Llene los pocillos de la placa de muestras con tampón de ensayo o con las diluciones apropiadas de proteína. Evite introducir burbujas, ya que pueden generar ruido en la señal óptica.

Incluya uno o más pozos de referencia que omitan ya sea la proteína biotinilada o el compañero de unión. Abra la puerta del instrumento y observe la salida de luz del brazo sensor. Inserte la bandeja sensora en la plataforma, colocando las lengüetas de la bandeja en las ranuras de la plataforma.

Inserte la placa de muestra en el soporte de placas. Asegúrese de que la placa esté colocada plana y en la orientación correcta, tal como se indica en el soporte. Cierre la puerta e inicie el ensayo desde el programa de adquisición de datos.

Si los sensores aún requieren humedecimiento previo, seleccione la opción para retrasar el inicio del experimento. Finalmente, una vez que se complete toda la preparación de las muestras y tanto la placa de muestras como la bandeja de sensores estén cargadas en el instrumento, haga clic en el botón de inicio para ejecutar el ensayo. Después de realizar el ensayo, abra el software de análisis de datos y cargue la carpeta que contiene los datos.

Haga clic en la pestaña de procesamiento para ver un menú de procesamiento paso a paso y los datos cinéticos en bruto, con cada sensor asignado a un color diferente bajo la selección de datos. Haga clic en el botón de selección de sensores en el mapa de la placa de muestras. Designe los pocillos para uno o dos sensores de control como pocillos de referencia en el menú de procesamiento.

Marque la casilla de sustracción y seleccione los pocillos de referencia para restar la señal de referencia de la señal de todos los demás sensores. Alinee todas las trazas a Y igual a cero utilizando el paso de alineación del eje Y. Luego, seleccione la línea base como paso de alineación para el rango de tiempo.

Introduzca los últimos 10 segundos de esa línea base. Hacer clic dentro de ese paso de línea base mostrará el alineamiento. A continuación, marque la casilla de corrección entre pasos para minimizar los desplazamientos de señal entre los pasos de asociación y disociación.

Seleccione una línea para el período de línea base o disociación. En la mayoría de los casos, seleccione la función de filtrado KY gole y haga clic en procesar datos para proceder a inspeccionar visualmente los datos finales del proceso en el panel inferior derecho. Para analizar los datos, haga clic en la pestaña de análisis en el análisis de datos para el paso a analizar, y elija asociación y disociación.

Para el modelo, seleccione uno a uno para el ajuste. Elija ajuste global. Para agrupar por, seleccione color y luego r máx desvinculado por sensor, para permitir el ajuste independiente de la respuesta máxima de la señal tras la unión saturante del compañero a la proteína inmovilizada. Finalmente, haga clic en ajustar curvas para iniciar el análisis de regresión no lineal.

Examine los resultados del ajuste, que incluyen la superposición de curvas de regresión con trazas de datos del sensor, gráficos de los residuos del ajuste y una tabla con los valores de los parámetros determinados y las estadísticas. Aquí se muestran la cinética de unión y disociación en tiempo real mediante BLI. Este experimento comenzó con un paso de línea base de 10 minutos, ya que los sensores habían sido previamente humedecidos brevemente; luego, se cargó el épsilon biotinilado sobre los sensores.

No se detectó disociación de epsilon durante todas las etapas restantes, como se observa en la curva de referencia, a la que no se añadió ningún compañero de unión. Un segundo sensor de referencia carecía de proteína movilizada y mostró una unión no específica baja del compañero de unión. Se utilizaron diversas concentraciones de F1 menos epsilon en la etapa de asociación para los sensores A a F con el fin de ajustar los resultados globalmente y obtener los mejores valores para la constante de velocidad de asociación y la constante de disociación en equilibrio KD; los resultados se procesaron, produciendo los trazos de datos azules.

En este caso, se restó la traza del sensor de referencia de las trazas de la muestra para corregir el enlace no específico del compañero de enlace y la deriva del señal del sistema. En el paso de análisis de datos, todas las curvas se ajustaron globalmente con un modelo uno a uno. El ajuste global supone la disociación completa del compañero de enlace.

Se muestra aquí un experimento diferente en el que la enzima se unió al épsilon inmovilizado en el sensor en presencia de un milimolar de A-T-P-A-D-T-A. Esto predispone a la mayoría de los complejos F1 épsilon a asumir la conformación no inhibidoria, que se disocia fácilmente. Luego, los sensores se trasladaron a pozos de disociación que contenían tampón de ensayo con diferentes ligandos. Esto demuestra los efectos de distintos ligandos sobre la conformación del épsilon.

Por ejemplo, la exposición al GP de magnesio y al fosfato redujo considerablemente la disociación neta, lo que indica que epsilon cambió su conformación hacia un estado inhibidor estrechamente unido. Al configurar por primera vez ensayos BLI, es importante incluir controles para evaluar la unión no específica de la proteína a los sensores y determinar si dicha unión no específica varía significativamente con las concentraciones de proteína que se utilizarán. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, programar y analizar ensayos BLI para medir la cinética de las interacciones entre proteínas y apreciar eso.

BLI permite una prueba directa de los efectos de ligandos pequeños sobre las interacciones proteína-proteína.