Análisis de las interacciones ADN-proteína con la interferometría de biocapas basada en estreptavidina
17 de enero de 2025
Este artículo describe un protocolo para estudiar las interacciones ADN-proteína utilizando un sistema de interferometría de biocapas (BLI) basado en estreptavidina. Describe los pasos y consideraciones esenciales para utilizar la cinética de enlace básica o avanzada para determinar la afinidad de enlace de equilibrio (KD) de la interacción.
Las interacciones de las biomoléculas, incluidas las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN, son esenciales en la investigación bioquímica. En este estudio utilizamos la interferometría de biocapas, o BLI, una técnica eficiente para analizar estas interacciones. Nos centramos en la proteína de replicación A y su afinidad de unión a un ADN de una sola cadena para mostrar los principios y capacidades de BLI.
La interferometría de biocapas es un método fácil y rentable para estudiar la cinética de proteínas. Permite una monitorización rápida en tiempo real de las interacciones de las proteínas y ofrece un flujo de trabajo sencillo con menos complejidad que otras técnicas. En nuestro laboratorio, estudiamos el impacto de las modificaciones postraduccionales en la estructura y función de las proteínas que son esenciales para mantener la estabilidad del genoma.
Estas modificaciones pueden iniciar efectos en cascada a través de las vías de replicación y reparación. Mediante el estudio de las interacciones de las proteínas, nuestro objetivo es descubrir los mecanismos subyacentes que salvaguardan la integridad del genoma. Para comenzar, prepare 12,5 nanomolares de tres sustratos de cebo poly dT 32 monocatenarios bio de primera calidad y cuatro concentraciones de RPA utilizando tampón BLI.
Con una pipeta, agregue 250 microlitros de tampón BLI en dos tubos de microfuga de 0,5 mililitros y etiquételos como AND. En una placa separada de 96 pocillos, pipetee 200 microlitros de tampón BLI en un pocillo. Coloque la bandeja de biosensores en la placa de 96 pocillos de modo que un biosensor se sumerja en el tampón BLI.
En el software, haga clic en la opción hidratar y configure el temporizador en 10 minutos. Ajuste la configuración de ejecución para cada paso, línea base, asociación y disociación. Pulsa ejecutar en el software y sigue las instrucciones del mensaje de aviso.
Coloque dos bahías en el soporte del tubo y conecte el biosensor hidratado al sistema BLI. Deslice el soporte del tubo debajo del biosensor en la posición A y controle la línea de base para el biosensor. Después de completar la línea de base inicial, abra la tapa y agregue cuatro microlitros de tampón BLI al soporte de caída.
Deslice el soporte de caída hacia la derecha debajo del mismo biosensor en la posición B.Una vez que la tapa esté cerrada, controle la curva BLI en el software. A continuación, abra la tapa y sustituya el tubo A por el tubo D.Deslice el nuevo tubo por debajo del biosensor en la posición A antes de cerrar la tapa y analice el paso de disociación en la interfaz. Coloque el tubo A en el soporte del tubo.
Conecte el biosensor hidratado al sistema BLI y deslice el soporte del tubo debajo del biosensor como se muestra anteriormente. A continuación, haga clic en ejecutar en la interfaz del software para la configuración básica. Después de agregar cuatro microlitros de cebo de ADN monocatenario de 12,5 nanomolares al portagotas y deslizarlo debajo del biosensor para el paso de asociación, monitoree la curva BLI en el software.
Luego abra la tapa para reemplazar el tubo A con D. Deslícelo debajo del biosensor y continúe con el paso de disociación. Una vez completado el paso de disociación, abra la tapa y separe el biosensor. A continuación, coloque el biosensor en la bandeja que contiene el tampón BLI.
Con una pipeta, agregue 250 microlitros de tampón BLI a 10 tubos de microfuga negra de 0,5 mililitros. Etiquete los tubos como A1 a A5 y D1 a D5. Complete los detalles experimentales en la interfaz del software y presione el botón de cálculo para procesar la información. En una pipeta de placa separada de 96 pocillos, 200 microlitros de tampón de extracción en el pocillo, correspondiente a la posición del biosensor hidratado.
Después de colocar el tubo A1 en el soporte del tubo, conectar el biosensor recubierto de cebo al sistema BLI y deslizar el tubo debajo del biosensor, presione ejecutar en el software. Una vez completado el paso inicial de referencia, abra la tapa y agregue cuatro microlitros de tampón BLI al soporte de gotas. Deslice el soporte de caída debajo del biosensor y controle el paso de asociación en la interfaz BLI.
Reemplace el tubo A1 por D1. Deslícelo debajo del biosensor y cierre la tapa. A continuación, supervise el paso de disociación en la interfaz BLI. Una vez completado el paso de disociación, abra la tapa, retire el biosensor y vuelva a colocarlo en su bandeja que contiene tampón BLI.
A continuación, coloque el biosensor recubierto de cebo y coloque el tubo A2 en el soporte del tubo. Deslice el tubo debajo del biosensor y haga clic en ejecutar en el software. Después del paso de referencia, agregue cuatro microlitros de RPA de cinco nanomolares en el soporte de caída.
Deslice el soporte de caída debajo del biosensor y cierre la tapa. Supervise la curva de asociación en la interfaz del software. Retire el biosensor y sumérjalo en el tampón de extracción durante 30 segundos.
A continuación, sumerja el biosensor en el tampón BLI durante tres minutos. En la tabla etiquetada Lista de ejecución, marque la casilla de referencia para la concentración de analito de cero nanomolar para que sirva como curva de referencia, marque la casilla, analizar, para todas las concentraciones del analito. Seleccione el inicio de la asociación y el inicio de la disociación para la corrección de pasos, elija el ajuste global para el ensayo.
A continuación, haga clic en analizar para procesar los datos. Para exportar los datos ajustados, haga clic con el botón derecho en el gráfico generado a partir de los datos analizados. Seleccione exportar datos, luego elija texto o datos, haga clic en archivo y luego busque para guardar los datos en formato DAT.
Abra el software y seleccione cinética avanzada en el panel izquierdo. Después de colocar una placa de 96 pocillos en la bandeja del biosensor y agregar 200 microlitros de tampón BLI a cinco pocillos, inserte la bandeja del biosensor en la placa para hidratar los sensores. Mientras los biosensores se hidratan, pipetee 250 microlitros de tampón BLI en 10 tubos de centrífuga negra de 0,5 mililitros.
Complete los detalles experimentales en la interfaz del software y presione el botón de cálculo para procesar la información. Después de deslizar el soporte del tubo con el tubo A1 debajo del biosensor, haga clic en ejecutar para obtener la línea de base inicial. Agregue cuatro microlitros del tampón BLI al soporte de caída.
Deslice el soporte de caída debajo del biosensor, cierre la tapa y controle la curva de carga en el software. El cambio espectral durante la unión de RPA utilizando cinética básica demostró un aumento dependiente de la dosis en la fuerza de unión con una saturación alcanzada a 40 nanomolares. El cambio espectral durante la unión de RPA mediante cinética avanzada mostró de manera similar una unión dependiente de la dosis, pero con biosensores individuales utilizados por concentración para mejorar la precisión.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para estudiar interacciones ADN-proteína utilizando interferometría de capa biológica (BLI). Destaca la eficiencia de la BLI en el análisis de afinidades de unión y el impacto de las modificaciones postraduccionales en la función proteica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Interacciones proteína-ADN
- Cinética de unión
Antecedentes
- Las interacciones entre biomoléculas son cruciales en la investigación de bioquímica.
- La interferometría de capa biológica (BLI) es un método rentable para estudiar la cinética de proteínas.
- La técnica permite el monitoreo en tiempo real de las interacciones.
- Las modificaciones postraduccionales pueden afectar la estructura y la función de las proteínas.
Objetivo del estudio
- Demostrar los principios de la interferometría de capa delgada (BLI).
- Analizar la afinidad de unión de la proteína de replicación A por el ADN de cadena sencilla.
- Proporcionar un flujo de trabajo sencillo para estudiar interacciones proteicas.
Métodos Utilizados
- Sistema de interferometría de capa biológica basado en estreptavidina.
- Análisis básico y avanzado de cinética de unión.
- Monitoreo en tiempo real de interacciones proteína-ADN.
- Evaluación de la afinidad de unión en equilibrio (K D).
Resultados principales
- Demostración exitosa de la ILB para el estudio de interacciones ADN-proteína.
- Determinación de la afinidad de unión para la proteína de replicación A.
- Conocimientos sobre el impacto de las modificaciones postraduccionales.
- Validación de la ILB como método confiable para el análisis de cinética proteica.
Conclusiones
- La interferometría de capa fina (BLI) es una herramienta eficaz para estudiar las interacciones de biomoléculas.
- El método simplifica el análisis de la cinética de unión.
- Comprender las interacciones proteína-ADN es fundamental para la investigación sobre la estabilidad del genoma.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo de las interacciones ADN-proteína es fundamental para la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. La interferometría de capa biológica (BLI) basada en estreptavidina permite mediciones en tiempo real y sin marcado de la cinética de unión, lo que respalda la confianza predictiva en la exploración de vías biológicas y en la selección de carteras. La capacidad de obtener constantes cinéticas precisas acelera la toma de decisiones en puntos críticos de inflexión en la industria biofarmacéutica.&D.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de hipótesis sobre la unión proteína-ADN relacionadas con la función de la vía.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar cinéticas de asociación y disociación en tiempo real.
- Facilita la validación funcional del blanco mediante la determinación precisa de la KD.
- Mejora la confianza predictiva para avanzar blancos en la fase de descubrimiento.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara ensayos validados de unión ADN-proteína para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Proporciona resultados cinéticos cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos.
- Permite una evaluación rápida y escalable de las interacciones de unión en múltiples condiciones.
- Facilita la evaluación confiable de compuestos al minimizar la complejidad y la variabilidad del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona hallazgos mecanicistas con vías relevantes para la enfermedad al aclarar la dinámica de las interacciones proteína-ADN.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al apoyar estudios de biomarcadores y vías metabólicas.
- Reduce el riesgo de traslación al permitir una evaluación cuantitativa y robusta de las interacciones moleculares.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El análisis de interacciones ADN-proteína basado en BLI se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación basada en hipótesis de la unión proteína-ADN y de los mecanismos de las vías.
- Selección: Proporciona datos cinéticos cuantitativos estandarizados para la preparación y reproducibilidad de ensayos.
- Análisis: Ofrece constantes de asociación, disociación y equilibrio para análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los conocimientos mecanicistas con sistemas relevantes para enfermedades y estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para diversos estudios de interacciones proteína-ADN y proteína-proteína.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Optimiza los flujos de trabajo mediante ensayos cinéticos estandarizados, reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y promueve el avance eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de los activos en fase de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de ensayos cinéticos y la interpretación de datos.
- Necesita acceso a instrumentación de interferometría de capa biológica (BLI) y software analítico compatible.
- Exige estandarización entre equipos para los protocolos de ensayo y el análisis de datos.
- Puede requerir adaptación para diferentes sustratos proteicos o de ADN y sistemas modelo.
- Depende de la calidad del biosensor y de la optimización del tampón para obtener resultados reproducibles.
