Expansión ex vivo de células asesinas naturales a partir de células mononucleares de sangre periférica

Las células asesinas naturales, NK, son linfocitos granulares grandes que eliminan tumores e infecciones microbianas.

Para la expansión de células NK ex vivo, tome una suspensión de células mononucleares de sangre periférica, PBMC, que contengan una población heterogénea de linfocitos, incluidas las células NK. Agregue células alimentadoras irradiadas, células linfoblastoides no proliferantes, que expresan interleucina 21 unida a la membrana, mIL-21, necesaria para activar y expandir las células NK.

Agregue el cocultivo en un pozo de cultivo especializado con una membrana permeable al gas en la parte inferior, lo que permite el intercambio de gases. Las células se asientan y proliferan durante un período prolongado sin necesidad de pasar.

Agregue interleucina 2, IL-2 e interleucina 15, IL-15: citocinas para la proliferación de células NK. Incubar durante un período adecuado en condiciones fisiológicas.

mIL-21 en las células alimentadoras se une a un receptor heterodimérico específico en las células NK. La IL-15 y la IL-2 exógenas se unen a sus respectivos receptores. La unión induce diferentes vías de señalización posteriores, activando la expresión génica, limitando la senescencia celular y conduciendo a una proliferación prolongada de células NK.

Mediante citometría de flujo, evalúe la expansión de las células NK a intervalos de tiempo regulares.

Grafique los datos registrados para analizar la tasa de expansión de las células y su pureza: crecimiento selectivo del tipo de célula NK objetivo. La expansión múltiple durante el período de incubación indica una proliferación sostenida mientras se mantiene una alta pureza.

Lave las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, y 100 células de 221 mIL-21 irradiadas con rayos gamma por separado mediante centrifugación a 400 g durante 5 minutos con 10 mililitros de medios R-10.

Después de la centrifugación, guarde 1 x 10⁶ PBMC para citometría de flujo y mezcle 5 x 10⁶ PBMC con 10 x 10⁶ 100 células 221-mIL-21 irradiadas con rayos gamma en una placa especial de 6 pocillos. Agregue 30 mililitros de medios R-10 suplementados con interleucina-2 humana e interleucina-15 humana a la misma placa de 6 pocillos e incube la placa a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono reemplazando el medio cada tres o cuatro días.

Durante la incubación, registre el número total de células asesinas naturales o PBNK de sangre periférica, la viabilidad y realice una citometría de flujo cada tres o cuatro días para calcular la tasa de expansión de las células NK.