Aislamiento de células asesinas naturales del tejido hepático para la expansión selectiva

Para aislar las células asesinas naturales, o células NK, glóbulos blancos especializados involucrados en la inmunidad innata, comience con tejido hepático humano que contenga diversas poblaciones celulares, incluidas células que contienen grasa, eritrocitos, granulocitos, linfocitos y otras células asociadas atrapadas dentro de una matriz extracelular rica en colágeno o ECM.

Pica el tejido en trozos pequeños y transfiérelos a un tubo que contenga colagenasa, una enzima proteolítica. La colagenasa escinde el colágeno, altera la matriz y afloja las células unidas a la MEC.

Inserte el tubo en un disociador de tejidos. Esta disociación mecánica desintegra aún más la ECM para liberar células sueltas en la solución. Filtre el contenido para eliminar el tejido no digerido y los fragmentos de ECM y recolecte el filtrado que contiene varias células.

Vuelva a suspender las células en un tampón que contenga polivinilpirrolidona o perlas de sílice recubiertas de PVP. Las perlas de PVP se unen selectivamente a las células que contienen grasa, separándolas eficazmente del resto de las células.

Centrifugar a baja velocidad para granular la población celular; desechar el sobrenadante que contiene desechos y células grasas unidas a perlas. Vuelva a suspender el gránulo y superponga la suspensión celular en un tubo que contenga un medio de gradiente de densidad para separar las células en función de sus densidades.

Centrífuga a baja velocidad. Los eritrocitos y granulocitos de mayor densidad se asientan en el fondo, mientras que los linfocitos aparecen en la interfase entre dos líquidos.

Recolecte las células de la interfase y cultívelas en un medio selectivo para la expansión de células NK.

Comience identificando y seccionando las áreas de tejido viables utilizando equipo quirúrgico estéril para obtener linfocitos. Luego, coloque los tejidos seccionados en 30 mililitros de HBSS sin calcio ni magnesio, y mantenga el tejido en hielo hasta que esté listo para el aislamiento.

Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad, pique el tejido en cubos de menos de 0,5 centímetros con cuchillas de afeitar y fórceps estériles. Coloque los trozos de tejido picados, no más de 4 gramos, en los tubos disociadores de tejido y agregue 10 mililitros de colagenasa IV a los trozos de tejido.

Para picar bien el tejido, trate los tubos disociadores de tejido en un disociador de tejido a 37 grados Celsius. Después de retirar los tubos del disociador de tejidos, triture el tejido picado a través de un colador de células de nailon de 40 micras con la parte posterior de una jeringa de 5 mililitros. Deseche los fragmentos grandes sin digerir.

Centrifugar el eluyente recogido a 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y aspirar el sobrenadante antes de volver a suspender los gránulos celulares en un 30% de sílice recubierta de polivinilpirrolidona para eliminar las células grasas. Gire las células como se describe, antes de volver a suspender el sedimento celular en 9 mililitros de medio R-10.

Para separar los linfocitos de los glóbulos rojos y las células polimorfonucleares, coloque cuidadosamente la suspensión celular sobre 4 mililitros de Ficoll o medios de separación de linfocitos. Separar las capas centrifugando a 400 g durante 23 minutos a temperatura ambiente con la aceleración y los frenos apagados. Luego, decanta cuidadosamente la capa media superior y recolecta la interfase que contiene linfocitos infiltrantes de tejido.

Enjuague las células con 10 mililitros de medio y proceda al análisis del protocolo primario de expansión de células asesinas naturales o NK.