Name: Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a purificar y expandir células iNKT de bazo de ratón mediante separación inmunomagnética. Este protocolo logra una expansión de 30 veces en dos semanas, facilitando estudios inmunológicos in vitro e in vivo.

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Agradecemos a Paolo Dellabona y Giulia Casorati por el apoyo científico y la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos al NIH Tetramer Core Facility por el tetrámero CD1d de ratón. El estudio fue financiado por la Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) y la beca de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) 2019-22604 (a G.D.).

Los procedimientos aquí descritos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (no. 1048) en el Instituto Científico San Raffaele.
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles. Todos los reactivos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Procesamiento del bazo
<ol><li>Eutanasiar ratones iVα14-Jα18 por inhalación de CO2 según la política institucional. NOTA: Los ratones iVα14-Jα18 deben tener 8 semanas de edad o más. Para evitar el rechazo de las células por la transferencia in vivo de las células, considere que las células aisladas de ratones hembra pueden transferirse adoptivamente tanto en receptores machos como hembras, mientras que las células aisladas de ratones machos pueden transferirse solo en receptores machos. Para los experimentos in vitro, no se debe considerar ningún sesgo de género. Se pueden agrupar más ratones para obtener más células.</li>
	<li>Diseccionar el bazo del ratón y aplastarlo a través de un colador celular de 70 nm para obtener una suspensión unicelular en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero bovino fetal (FBS) al 2%.</li>
	<li>Centrifugadora a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante por inversión y procese con tampón de lisis eritrocitaria. Resuspender el pellet celular con 1 mL de tampón de lisado ACK (cloruro de amonio-potasio) estéril, incubar durante 3 min a temperatura ambiente y bloquear con 5 ml de PBS con 2% de FBS. Centrifugadora a 300 x g durante 5 min. NOTA: ACK está disponible comercialmente; consiste en una solución de 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3y 0,1 mM Na2EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) disuelto en bidistilled H2O, pH 7.2-7.4. Si es casero, esterilice por filtración con un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Retire el sobrenadante por inversión. Resuspend el pellet celular en 3 mL de PBS con 2% de FBS y eliminar los residuos de grasa mediante pipeteo. Si es necesario, agrupe las células provenientes de diferentes ratones.</li>
	<li>Cuente las células y mantenga 50 μL para el análisis FACS.</li>
</ol>2. Enriquecimiento de células T
NOTA: Para los pasos de enriquecimiento, trabaje rápido, mantenga las celdas frías y use soluciones preenfriadas a 4 ° C durante la noche y luego mantenidas en hielo
<ol><li>Centrifugadora a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspendir todas las células en la cantidad adecuada de PBS con 2% de FBS (500 μL para 107 células) y bloqueador de Fc (2.5 μL x 107 células); incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavar con 1-2 ml de tampón de separación MACS (MB) por 107 celdas totales y centrifugar a 300 x g durante 10 min. NOTA: El búfer MACS está disponible comercialmente. Consiste en PBS pH 7.2, 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA. Si es casero, esterilice por filtración con un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Retire el sobrenadante por inversión y manche las célulascon CD19-FITC y H2(IA b)-FITC (use 5 μL x 107 células en 100 μL de MB). Mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4-8 °C.</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 1−2 mL de MB por 107 células y centrifugar a 300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Pipetee completamente el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 90 μL de MB por 107 células totales. Añadir 10 μL de Microbeads Anti-FITC por cada 107 células totales. Mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4-8 °C.</li>
	<li>Lave las células agregando 1−2 ml de MB por 107 células y centrífuga a 300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Pipetee el sobrenadante por completo y resuspenda hasta 1.25 x 108 celdas en 500 μL de MB.</li>
	<li>Coloque una columna LD en el campo magnético del separador MACS para proceder al agotamiento. Para evitar obstrucciones, aplique un filtro de preseparación en la columna LD y enjuague con 2 ml de MB.</li>
	<li>Cuando el depósito de la columna esté vacío, aplique la suspensión de celda sobre el filtro. Recopile las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1 ml de MB, solo cuando el depósito de columna esté vacío. Recoger el efluente total, que se enriquecerá en células T, y contar las células. Mantenga siempre 50 μL para el análisis FACS.</li>
</ol>3. Enriquecimiento celular iNKT
<ol><li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante por inversión.</li>
	<li>Teñir las células con CD1d-tetrámero-PE (ratón PBS57-CD1d-tetrámero), según la titulación de anticuerpos en 50 μL de MB por 106 células. Mezclar bien e incubar durante 30 min en la oscuridad sobre hielo. NOTA: El procedimiento también se puede realizar con tetrámeros mCD1d marcados con APC y perlas anti-APC; ajustando los fluorocromos utilizados en la siguiente tinción en consecuencia. En el presente protocolo se utilizaron tetrámeros PBS-57-CD1d-ratón proporcionados por los NIH. La αgalactosilceramida (αGal-Cer) es el antígeno prototípico reconocido por las células iNKT; PBS-57 es un análogo de αGal-Cer con solubilidad mejorada9; la instalación de tetrámeros de los NIH proporciona ligando PBS-57 complejado a tetrámeros CD1d. Sin embargo, otros dímeros/tetrámeros/dextramers CD1d están disponibles comercialmente y pueden cargarse con un antígeno lipídico como αGal-Cer. Prevemos la posibilidad de ajustar el protocolo para su uso.</li>
	<li>Lave las células agregando 1−2 ml de MB por 107 células y centrífuga a 300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Pipetear el sobrenadante por completo y resuspendir el pellet celular en 80 μL de MB por 107 células totales. Añadir 20 μL de Microbeads Anti-PE por cada 107 células totales. Mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4-8 °C.</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 1−2 mL de MB por 107 células y centrifugar a 300 x g durante 10 min.</li>
	<li>Pipetee el sobrenadante por completo y resuspenda hasta 108 células en 500 μL de MB. De lo contrario, si las celdas exceden10 8, ajuste el volumen en consecuencia.</li>
	<li>De acuerdo con el recuento de células, coloque una columna LS (hasta10 8) o MS (hasta 107) en el campo magnético del separador MACS. Enjuague la columna con MB (3 ml para LS, 500 μL para MS).</li>
	<li>Aplique la suspensión de celdas sobre la columna.</li>
	<li>Recoger las células no etiquetadas que pasan a través. Lave la columna 3 veces agregando la cantidad adecuada de MB (3 x 3 ml para la columna LS, 3 x 500 μL para la columna MS) solo cuando el depósito de columna esté vacío. El efluente total es la fracción negativa.</li>
	<li>Retire la columna del campo magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección.</li>
	<li>Pipetear MB en la columna (5 ml para la columna LS o 1 ml para la columna MS); empuje el émbolo proporcionado en la columna y elimine la fracción positiva (enriquecida en celdas iNKT).</li>
	<li>Para aumentar aún más la recuperación de células iNKT, centrífuga la fracción negativa a 300 x g durante 10 min y repita los pasos 3.6-3.7 con una nueva columna LS o MS. Agrupe las fracciones positivas y determine el recuento de células. Mantenga 50 μL de fracciones positivas y negativas para el análisis FACS.</li>
	<li>Verifique los pasos de purificación mediante el análisis FACS. Las muestras incluyen: bazo ex-vivo, fracción enriquecida con células T, fracción positiva iNKT y fracción negativa iNKT. Teñir las células con: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC y DAPI. NOTA: La recuperación esperada de un ratón iVα14-Jα18 es de 2x106 celdas iNKT.</li>
</ol>4. Activación y expansión de la célula iNKT
<ol><li>Active las células iNKT purificadas con perlas magnéticas anti-CD3/CD28 activadoras T de ratón en una proporción de 1:1.<ol>
<li>Centrifugar la fracción positiva de la célula iNKT a 300 x g durante 5 min.</li>
		<li>Mientras tanto, transfiera el volumen apropiado de perlas magnéticas anti-CD3 / CD28 a un tubo y agregue un volumen igual de PBS, vórtice durante 5 segundos. Coloque el tubo sobre un imán durante 1 minuto y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas magnéticas lavadas en el volumen adecuado de RPMI completo (medio RPMI 1640, FCS inactivado por calor al 10%, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, 10 U / ml de penicilina y estreptomicina, 50 μM β-mercaptoetanol) para tener 5 x 105 células iNKT en 1 ml. Utilice esta suspensión para resuspendir la fracción positiva iNKT centrifugada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa 1 mL de la suspensión celular (5 x 105 células iNKT) y perlas magnéticas anti-CD3/CD28 en una placa de 48 pocillos con 20 U/mL IL-2 e incubar a 37 °C.</li>
	<li>Después de 5 días, agregue 10 ng / ml de IL-7.</li>
	<li>Divida las células 1:2 cuando alcancen el 80-90% de confluencia, siempre agregue 20U/mL IL-2 y 10 ng/mL IL-7. En estas condiciones, las células iNKT se pueden expandir hasta por 15 días.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
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<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
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<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí mostramos un protocolo reproducible y factible para obtener millones de células iNKT listas para usar. Debido a la escasez de estas células in vivo, era muy necesario un método para expandirlas. El protocolo que proponemos no requiere ni una instrumentación particular ni un alto número de ratones. Explotamos ratones transgénicos iVα14-Jα18 a propósito para reducir el número de ratones necesarios para el procedimiento.
Otro protocolo exitoso para la expansión de células iNKT de ratones tra...

Las células T asesinas naturales invariantes (células iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T αβ (TCR) semiinvariante, formado en ratones por una cadena invariante Vα14-Jα18 emparejada con un conjunto limitado de diversas cadenas Vβ1,que es específico para los antígenos lipídicos presentados por la molécula relacionada con MHC clase I CD1d2. Las células iNKT se someten a un programa de selección de agonistas que resulta en la adquisición de un fenotipo efector activado/innato ya en el timo, que se produce a través de varias etapas de maduración3,4,produciendo unsubconjunto CD4+ y un subconjunto CD4.. A través de este programa, las células iNKT adquieren fenotipos efectores T auxiliares (TH),a saber, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) y TH17 (iNKT17), identificables por la expresión de los factores de transcripción T-bet, GATA3, PLZF y RORγt, respectivamente5. Las células iNKT reconocen una gama de lípidos microbianos, pero también son autorreactivas contra los lípidos endógenos que están regulados al alza en el contexto de situaciones patológicas de estrés celular y daño tisular, como el cáncer y la autoinmunidad2. Tras la activación, las células iNKT modulan las funciones de otras células efectoras inmunes innatas y adaptativas a través del contacto directo y la producción de citoquinas2.
Las investigaciones de las células iNKT han sido facilitadas por modelos de ratón, incluidos ratones deficientes en CD1d o deficientes en Jα18, y por la producción de tetrámeros CD1d cargados de antígenos más la generación de anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para el TCR semiinvariante humano. Sin embargo, la generación de la línea celular iNKT primaria de ratón ha resultado difícil. Para caracterizar mejor las funciones antitumorales de las células iNKT y utilizarlas para la terapia celular adoptiva, establecimos un protocolo para purificar y expandir las células iNKT esplénicas de ratones transgénicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, en el que las células iNKT son 30 veces más frecuentes que en ratones de tipo salvaje.
Las células iNKT expandidas pueden ser explotadas para ensayos in vitro, e in vivo al transferirse de nuevo a ratones. En este contexto, por ejemplo, hemos demostrado sus potentes efectos antitumorales7. Además, las células iNKT expandidas in vitro son susceptibles de modificación funcional a través de la transferencia o edición de genes antes de su inyección in vivo8,lo que permite un análisis funcional perspicaz de las vías moleculares, así como allanar el camino para terapias celulares avanzadas.

<table><tbody><tr><td>Solución de cloruro-amonio-potasio (ACK)</td><td>en casa</td><td></td><td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td></tr><tr><td>anti-FITC Microperlas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>microperlas anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>clon 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetrámero -PE</td><td>NIH tetrámero central</td><td></td><td>ratón PBS57-Cd1d-tetrámeros</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>100528</td><td>clon RM4-5</td></tr><tr><td>Fc bloqueador</td> BD <td>Bioscience</td><td>553142</td> Fetal Bovine Serum (FBS)Euroclon ECS0186L <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>inactivado por calor y filtrado .22 antes de usar</td></tr><tr><td>FOXP3 Tampón de tinción de factor de transcripción</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>clon AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampón MACS (MB)</td><td>albúmina sérica</td><td></td><td>bovina al 0,5% (BSA; Sigma-Aldrich) y EDTA de 2 mm</td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solución salina (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>clon H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 ratón T activador Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación y expansión de células t asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Las células T asesinas naturales invariantes (iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T semiinvariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos propios o microbianos presentados por la molécula no polimórfica MHC de clase I CD1d. Los estudios preclínicos y clínicos respaldan un papel de las células iNKT en el cáncer, la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas. Las células iNKT están muy conservadas en todas las especies y su investigación ha sido facilitada por modelos de ratón, incluidos ratones deficientes en CD1d o deficientes en iNKT, y la posibilidad de detectarlas inequívocamente en ratones y hombres con tetrámeros CD1d o mAbs específicos para el TCR semiinvariante. Sin embargo, las células iNKT son raras y necesitan ser expandidas para alcanzar números manejables para cualquier estudio. Debido a que la generación de la línea celular iNKT primaria de ratón in vitro ha demostrado ser difícil, hemos establecido un protocolo robusto para purificar y expandir las células iNKT esplénicas de los ratones transgénicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), en los que las células iNKT son 30 veces más frecuentes. Mostramos aquí que las células iVα14Tg iNKT esplénicas primarias se pueden enriquecer a través de un proceso de separación inmunomagnética, produciendo aproximadamente un 95-98% de células iNKT puras. Las células iNKT purificadas son estimuladas por perlas anti-CD3/CD28 más IL-2 e IL-7, lo que resulta en una expansión de 30 veces por día +14 del cultivo con una pureza del 85-99%. Las células iNKT expandidas se pueden manipular genéticamente fácilmente, proporcionando una herramienta invaluable para diseccionar los mecanismos de activación y función in vitro y, lo que es más importante, también en la transferencia adoptiva in vivo.

El protocolo descrito en este manuscrito permite enriquecer células iNKT del bazo de ratones transgénicos iVa14-Ja18 a través de un proceso de separación inmunomagnética resumido en la Figura 1A. Las células T del bazo total se seleccionan primero negativamente agotando las células B y los monocitos, seguidas de la clasificación inmunomagnética positiva de las células iNKT con tetrámeros CD1d cargados con antígeno lipídico PBS-57, que permiten teñir específicamente solo las células iNKT. Est...

Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Este protocolo permite la purificación de las células T INK, que son muy raras, y permite una expansión de 30 veces en su número. La purificación se puede realizar en un día y producir un gran número de células T INK listas para usar para estudios in vivo e in vitro en dos semanas. Demostrando el procedimiento estará Gloria Delfanti, una post-doc en el laboratorio.Después de diseccionar el bazo del ratón, aplastarlo a través de un colador celular de 70 nanómetros para obtener una suspensión de una sola célula en 10 mililitros de PBS con 2% FBS. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular con un mililitro de tampón estéril de cloruro de amonio potasio lisina.Incubar las células durante tres minutos a temperatura ambiente, luego bloquear con cinco mililitros de PBS con 2% FBS. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de PBS con 2% FBS y elimine los residuos de grasa mediante pipeteo.Para los pasos de enriquecimiento, mantenga las células frías y use soluciones preenfriadas a cuatro grados centígrados y luego mantenidas en hielo. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Resuspend todas las células en la cantidad adecuada de PBS con 2% FPS y bloqueador Fc e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Lavar con uno o dos mililitros de tampón de separación MACS por cada 10 millones de células y centrifugar a 300 veces G durante 10 minutos. Después de retirar el sobrenadante, tiñe las células con CD19-FITC y H2-IAb-FITC e incube durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados. Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 90 microlitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Agregue 10 microlitros de microperlas anti-FITC por cada 10 millones de células. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados.Lave las células agregando uno o dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda hasta 125 millones de células en 500 microlitros de tampón MACS. Coloque una columna LD en el campo magnético del separador MACS.Para evitar obstrucciones, aplique un filtro de preseparación en la columna LD y enjuáguela con dos mililitros de tampón MACS. Aplique la suspensión de celdas sobre el filtro y recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna. Lave el depósito de columna vacío tres veces con un mililitro de búfer MACS.Recoger el efluente enriquecido con células T y contar las células, manteniendo 50 microlitros para el análisis FACS. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, retire el sobrenadante y manche las células con CD1d tetramer-PE. Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en la oscuridad sobre hielo.Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Después de la centrifugación a 300 veces G durante 10 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 80 microlitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Agregue 20 microlitros de microperlas anti-PE por cada 10 millones de células.Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados. Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda hasta 100 millones de células en 500 microlitros de tampón MACS.De acuerdo con el recuento de celdas, coloque la columna LS o MS en el campo magnético del separador MACS y enjuague la columna con el búfer MACS. Aplique la suspensión de celdas sobre la columna, recoja las celdas sin etiquetar que pasan y lave la columna tres veces como se describió anteriormente. Esta es la fracción negativa.Retire la columna del campo magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección. Búfer MACS de pipete en la columna y empuje el émbolo proporcionado en la columna para eliminar la fracción positiva enriquecida en células T INK. Para aumentar aún más la recuperación de células T ink, centrífuga la fracción negativa a 300 veces G durante 10 minutos y repita los pasos anteriores con una nueva columna LS o MS.Extraiga las fracciones positivas y determine el recuento de células. Mantenga 50 microlitros de fracciones positivas y negativas para el análisis FACS para verificar la pureza. Para activar las células T INK en una proporción de uno a uno, transfiera el volumen apropiado de perlas magnéticas anti-CD3 y CD28 a un tubo y a un volumen igual de PBS, luego vórtice durante cinco segundos.Coloque el tubo sobre un imán durante un minuto y deseche el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas magnéticas lavadas en el volumen adecuado de RPMI. Centrífuga las células T INK purificadas a 300 veces G durante cinco minutos y mézclalas con perlas magnéticas anti-CD3 o CD28 activadoras en T del ratón.Placa un mililitro de la suspensión celular, perlas magnéticas anti-CD23 y CD28 en una placa de 48 pocillos con 20 unidades por mililitro IL-2, luego incubar a 37 grados Celsius. Después de cinco días, agregue 10 nanogramos por mililitro de IL-7. Divida las células por la mitad cuando alcancen entre el 80 y el 90% de confluencia, siempre añadiendo 20 unidades por mililitro de IL-2 y 10 nanogramos por mililitro de IL-7.En estas condiciones, las células T INK se pueden expandir hasta por 15 días. Usando este protocolo, las células T INK se enriquecen a partir del bazo de ratones transgénicos a través de un proceso de separación inmunomagnética. Después del enriquecimiento, las células se pueden expandir con perlas anti-CD3 y CD28, lo que resulta en una expansión de 30 veces en promedio para el día 14 del cultivo.La fuerte activación con perlas anti-CD3 y anti-CD indujo la regulación a la baja de la expresión de TCR de células T IMK en la superficie celular y apareció una población doble negativa. La mayoría de las células T INK expandidas son CD4 negativas. La caracterización de los factores de transcripción específicos del linaje PLZF y ROR gamma T permitió identificar los fenotipos NKT1, NKT2 y NKT17 en células T INK enriquecidas en el día cero y 14.Las células T INK enriquecidas muestran un fenotipo efector similar al T80, que se conserva después de 14 días de expansión, como lo confirma la secreción de interferón gamma e IL-4 después de la estimulación con PMA e ionomicina. Durante los pasos de purificación, recuerde trabajar rápidamente con soluciones preenfriadas y deshacerse de los residuos de grasa que se puedan ver durante el pipeteo. Las células T INK expandidas se pueden explotar para ensayos in vitro y transferencias in vivo a ratones, incluso después de modificaciones funcionales a través de transferencia o edición de genes.La expansión in vitro de las células T INK supera la limitación dada por la escasez, haciéndolas explotables en estudios preclínicos en los campos de la vigilancia inmune tumoral, las enfermedades infecciosas y la autoinmunidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Este video muestra el aislamiento de linfocitos, incluidas las células asesinas naturales o células NK, del tejido hepático humano para su expansión selectiva. La digestión enzimática y mecánica, seguida de la separación por gradiente de densidad, promueve el aislamiento de linfocitos, incluidas las células NK. Los linfocitos recolectados se pueden utilizar posteriormente para la expansión selectiva de las células NK.

Aislamiento de células asesinas naturales del tejido hepático para la expansión selectiva

Este video ilustra un método para aislar células T asesinas naturales invariantes, también conocidas como células iNKT. El procedimiento comienza con la inyección de un glicolípido sintético en un ratón para estimular la activación y proliferación de las células iNKT en el bazo. Posteriormente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y se incuban con complejos de reconocimiento de células iNKT marcados con fluoróforos, seguidos de una separación basada en perlas magnéticas, para...

Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

Aprende a purificar y expandir células iNKT de bazo de ratón mediante separación inmunomagnética. Este protocolo logra una expansión de 30 veces en dos semanas, facilitando estudios inmunológicos in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

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