La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de biomoléculas como el ADN y las proteínas en tampones acuosos en tiempo real utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra preparando primero las biomoléculas que se van a obtener de la imagen. A continuación, se configura el microscopio de fuerza atómica y se coloca una sonda en voladizo FM.

A continuación, se toman imágenes y analizan la superficie de la muestra y las biomoléculas de interés. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el tamaño general, la cantidad y la organización del ADN y las proteínas y los complejos biomoleculares heterogéneos en condiciones de amortiguación mediante microscopía de fuerza atómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las chaperonas moleculares, como cuál es la geometría STO de las chaperonas y el complejo de chaperonas cos para un cliente.

La demostración visual de proteínas de este método es beneficiosa, ya que los pasos de preparación de la sonda de palanca A FM y Kent pueden ser difíciles de aprender a partir de instrucciones impresas, en gran parte debido a las complejidades asociadas con su manipulación física. Para comenzar, Morgan Shannon y John Gertz, dos estudiantes de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento para comenzar a aislar las moléculas de proteína o ADN que se van a obtener y suspenderlas en un tampón acuoso. Después de confirmar la pureza de la muestra, incubarla en un tampón de absorción FM sobre hielo para promover la adherencia de la muestra a la mica.

Para las muestras de proteínas, utilice un tampón de pilas de 10 milimolares. Y para el tampón que contiene magnesio de ADN compuesto por 10 milimolares tris, pH 7.5 10 milimolares cloruro de sodio, dos milimolares de cloruro de magnesio es adecuado para montar la sonda A FM. Coloque el soporte de la sonda de celda líquida en la estación de acoplamiento de instalación en voladizo correspondiente.

Ubique el voladizo largo y grueso de la sonda de palanca de nitruro afilada que se utilizará para la obtención de imágenes. Transfiéralo con cuidado al soporte de la sonda de celda líquida, asegurándose de que la punta permanezca en posición vertical. A continuación, examine el voladizo bajo un microscopio óptico para asegurarse de que esté intacto y correctamente asentado en el soporte de la sonda de celda líquida.

A continuación, retire con cuidado la cabeza FM del conjunto de cola de milano del instrumento apretando el tornillo de la abrazadera de la cabeza neural. Invierta el cabezal FM y empuje firmemente el soporte de la sonda de celda líquida sobre los cuatro pines en la base del cabezal FM. Finalmente, regrese con cuidado la cabeza FM al instrumento de montaje de cola.

Para preparar aún más el FM antes de obtener imágenes de muestras, mueva las perillas del microscopio óptico integrado para ubicar la punta en voladizo, ajuste las flechas hacia arriba y hacia abajo del controlador óptico en el software para enfocar la punta en voladizo. Utilice las perillas de ajuste del láser para alinear el láser con la punta del voladizo. Este es uno de los pasos técnicamente más desafiantes del protocolo: el posicionamiento se realiza manualmente y requiere un ajuste preciso de la perilla.

La supervisión cuidadosa del láser en el punto de reflexión y el punto de iluminación aumenta la probabilidad de una alineación exitosa. A continuación, ajuste las perillas del detector de fotos en el cabezal FM para centrar el detector de fotos. Coloque una lámina de MICA recién cortada unida a un disco de muestra de metal a FM en el soporte de muestras magnetizado encima de la placa de soporte A FM.

Gire la placa de soporte FM para que el disco de muestra quede posicionado para la obtención de imágenes iniciales. Utilice el control de superficie de enfoque del software del instrumento para mover el cabezal FM hacia la superficie del disco de muestra MICA. Hasta que las características distintivas en la superficie MICA o el reflejo de la punta estén enfocados, seleccione el icono de afinación en el software del instrumento y ajuste el voladizo.

La frecuencia de resonancia de las sondas MSNL o SNL recomendadas es de 20 a 60 kilohercios. Seleccione un desplazamiento de pico del 5% para obtener una imagen de la muestra MICA. Primero, conecte la sonda en la superficie MICA, establezca el tamaño de escaneo inicial en 10 micrómetros y la velocidad de escaneo en un hercio.

Capture imágenes de escaneo completas del campo de 10 micrómetros. A continuación, disminuya el tamaño del escaneo a cinco, uno y 0,5 micrómetros y capture imágenes completas de cada campo. Desconecte la sonda haciendo clic una vez en el icono de desconexión en el software del instrumento.

Para obtener imágenes de biomoléculas de interés, mezcle cinco microlitros de la muestra preparada con 45 microlitros de tampón de absorción fresco. Agregue con cuidado 50 microlitros de la solución que contiene la biomolécula de 0,5 microgramos por mililitro directamente sobre la superficie de la MICU. Haga una pausa de cinco minutos para permitir que las biomoléculas de la muestra se adhieran a la superficie de Micah.

A continuación, pipetee de 50 a 100 microlitros adicionales de tampón de absorción en el soporte de la sonda de celda líquida. Tenga cuidado de no tocar la sonda, un cabezal FM o MICA con la punta de pipeta, reajuste el fotodetector y realinee el láser al voladizo según sea necesario. A continuación, utilice el software del instrumento para volver a conectar la sonda.

Aumente el tamaño del escaneo para identificar regiones de interés. Una vez completada la imagen, seleccione el icono de retirada en el software del instrumento varias veces para desconectar la sonda. Finalmente, use agua destilada para enjuagar a fondo el soporte de la sonda de celda líquida y el disco de muestra.

Luego pruébelo con aire comprimido. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen A FM. El sustrato de mica proporciona una superficie molecularmente plana en la que el ADN y las proteínas pueden absorber.

La obtención de imágenes de MICA antes de las muestras de biomoléculas proporciona un control negativo y una evaluación del ruido de las imágenes. También proporciona un nivel de seguridad de que el voladizo está correctamente ajustado y que las imágenes de muestras posteriores serán exitosas. El ADN plasmático de doble cadena, presumiblemente superenrollado, se identifica fácilmente por su apariencia asimétrica y su depósito uniforme en el sustrato de Micah, que antes no tenía nada de especial.

Los complejos de proteínas de tamaños de partícula discretos también se distinguen de manera única del sustrato Micah. Las diferencias en el tamaño de partícula indican la heterogeneidad de la muestra y pueden ser útiles para aproximar la proteína, la geometría estoica compleja o la actividad bioquímica. La forma diagonal general y la orientación constante de las partículas de proteína observadas.

Aquí hay un artefacto de imagen, ya que las proteínas se orientarían en el sustrato de Micah de manera aleatoria. Las posibles causas del artefacto observado o una anormalidad física de la punta o una imagen FM a dos velocidades de escaneo mientras que la convolución de la punta impide la medición de la longitud absoluta en los ejes X e Y, la medición de la altura o los ejes Z y las mediciones relativas X e Y pueden ser, no obstante, útiles para estimar las propiedades biofísicas de las biomoléculas fotografiadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ajustar con precisión el voladizo y alinear el fotodetector siguiendo este procedimiento básico de FM.

Se pueden agregar otros pasos, incluido el uso de una celda de fluido de intercambio tampón, para responder preguntas adicionales, como la capacidad de las chaperonas moleculares para afectar la liberación de receptores de esteroides de sus elementos de respuesta al ADN. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo obtener imágenes de proteínas de ADN y complejos biomoleculares utilizando microscopía de fuerza atómica en condiciones de amortiguación.