Un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre los neutrófilos y el biofilm

Una biopelícula es una comunidad de bacterias adheridas a la superficie incrustadas dentro de una matriz de sustancias poliméricas extracelulares, EPS, de origen microbiano.

Para estudiar las interacciones entre células inmunitarias y biopelículas in vitro, tome un portaobjetos con un canal que contenga una biopelícula de Staphylococcus aureus, un patógeno oportunista. Las bacterias modificadas expresan una proteína fluorescente para la detección microscópica. El canal se conecta a depósitos llenos de medios para suministrar nutrientes a las bacterias.

Agregue una suspensión de neutrófilos marcados con un tinte fluorescente de seguimiento celular. El medio también contiene un homodímero de etidio, que tiñe el ADN de las células muertas. Incubar en condiciones fisiológicas.

Los receptores de reconocimiento de patrones en los neutrófilos se unen a los patrones moleculares asociados a patógenos en las bacterias. La unión induce a los neutrófilos a fagocitar las bacterias y producir especies reactivas de oxígeno extracelulares o ROS, matando a las bacterias.

Para evadir la respuesta inmune, las bacterias liberan enzimas desintoxicantes que disminuyen la toxina ROS y leucocidina que causa la muerte celular. La leucocidina monomérica se une a receptores específicos en los neutrófilos y se multimeriza para formar un poro, alterando la integridad de la membrana y matando las células.

El homodímero de etidio ingresa a través de la membrana celular dañada, tiñendo las células muertas.

Bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio, un subconjunto de células bacterianas y neutrófilos parecen muertos, lo que indica una interacción neutrófilo-biopelícula.

Utilice una cepa fluorescente de S. aureus, como USA300 que expresa GFP, para facilitar las imágenes de microscopía. Incube neutrófilos con 100 BCD micromolares durante 30 minutos en un balancín a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono atmosférico. Asegúrese de que las muestras se incuben en la oscuridad y limite la exposición a la luz.

Para lavar el exceso de BCD, centrifugar los neutrófilos a 270 RCF durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los neutrófilos en HBSS fresco. Luego, agregue homodímero-1 de etidio a los neutrófilos teñidos con BCD a una concentración final de 4 micromolares para monitorear la muerte bacteriana y de neutrófilos.

Lave la biopelícula con HBSS y agregue 150 microlitros de neutrófilos a la biopelícula de S. aureus que se ha cultivado en microportaobjetos. Incube los microportaobjetos en una cámara humidificada durante 30 minutos. El número de células bacterianas se basará en los recuentos de células obtenidos del recubrimiento de biopelícula de 18 horas.

Visualice la interacción de la biopelícula de neutrófilos utilizando canales fluorescentes correspondientes a colorantes fluorescentes o longitudes de onda de excitación y emisión de proteínas.