Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

El objetivo general de esta metodología es medir la captación de glucosa y su transportador en diferentes subpoblaciones de monocitos. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo: ¿Cuál es la importancia del metabolismo de las células inmunitarias en los resultados de las enfermedades? Las principales ventajas de estas técnicas son que son rápidas, fáciles de realizar, no requieren material reactivo y solo necesitan un pequeño volumen de sangre.

En el transcurso de una hora después de recolectar las muestras de sangre en tubos con anticoagulante citrato ACD-B, coloque las muestras en una cabina de seguridad biológica. A continuación, agregue 100 microlitros de sangre de cada muestra en tubos individuales de polipropileno y trate las células con dos mililitros de solución de lisis 1X sobre hielo, pipeteando suavemente para mezclar. Después de 15 minutos, centrifugue las células y realice luego otras dos centrifugaciones en tampón de lavado.

Después del segundo lavado, utilice una pipeta para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad posible de los sobrenadantes y re-suspender los pellet en 100 microlitros de tampón de lavado sobre hielo. Para identificar las subpoblaciones específicas de monocitos, marque las células con cinco microlitros de los anticuerpos adecuados por cada 100 microlitros de células, durante 30 minutos sobre hielo y en la oscuridad. Al final de la incubación, lave las muestras dos veces en solución de lavado y fije las células con 200 microlitros de formaldehído al 0,5% en PBS.

Luego, analice las células dentro de las 24 horas en un citómetro de flujo capaz de detectar cuatro colores. Para evaluar la captación de glucosa de las subpoblaciones de monocitos, transfiera 90 microlitros de sangre de cada muestra a tubos individuales de polipropileno y agregue 10 microlitros del análogo fluorescente de glucosa de interés a la sangre. Agite suavemente los tubos para mezclar y cubra las muestras con papel de aluminio.

Luego, coloque las células a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos, seguido de su transferencia inmediata al hielo. A continuación, agregue cuatro mililitros de solución lisadora para FACS a los tubos y centrifugue las células. Después, realice una segunda centrifugación en tampón de lavado.

Decante el sobrenadante y tiña las células con los anticuerpos adecuados de interés durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Luego, lave las muestras con cuatro mililitros de tampón de lavado frío con hielo, re-suspenda los pellets en 200 a 300 microlitros de PBS frío con hielo y analice los tubos dentro de los 10 minutos siguientes. Para el análisis citométrico de flujo, utilice primero las muestras control no tiñidas y tiñidas individualmente para ajustar la compensación.

A continuación, en el software adecuado de análisis de células individuales, abra la primera muestra en un gráfico de dispersión directa frente a dispersión lateral, y delimite los monocitos como se ilustra. Luego, haga doble clic en la población de monocitos delimitada y delimite la población negativa para CD3. Ahora, haga doble clic en la población negativa para CD3 y configure el eje x para mostrar la tinción de CD14 y el eje y para mostrar la tinción de CD16.

A continuación, para medir la captación de glucosa o de su transportador en una subpoblación específica de monocitos, genere los histogramas apropiados. Luego, cuando existan poblaciones celulares definidas, utilice las muestras de control de IgG-FITC para establecer la compuerta y determinar el porcentaje total de monocitos positivos para CD14 en cada muestra. Aquí se muestra la estrategia inicial de compuerta para aislar los monocitos mediante la dispersión celular y la exclusión de linfocitos T al seleccionar dentro de la población negativa para CD3.

Luego, se seleccionan los monocitos según la expresión de CD14 sola o en combinación con CD16 para identificar los monocitos totales o las subpoblaciones de monocitos. Pueden observarse poblaciones distintas de monocitos positivos para el transportador de glucosa Glut-1 y positivos para CD14, especialmente en los leucocitos circulantes obtenidos de individuos positivos para VIH. También pueden observarse células positivas para CD14 y para Glut-1 dentro de subconjuntos específicos de monocitos en individuos no infectados por el VIH, aunque estas poblaciones son más pronunciadas en pacientes positivos para VIH.

Como era de esperar según los datos de expresión de los transportadores de glucosa, el análogo de glucosa 2-NBDG también es captado en mayores cantidades por células de individuos positivos para VIH. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en un plazo de una hora y media si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante limitar la exposición a la luz en todas las regiones.

Tras la captación de análogos de glucosa, las células pueden teñirse con anticuerpos de superficie celular para identificar poblaciones inmunitarias específicas que le interesen. Después de su desarrollo, este método puede utilizarse para determinar cómo el VIH afecta el metabolismo de las células inmunitarias, y también puede ser explorado por otros investigadores en diferentes campos, como la inmunología, la virología y la investigación del cáncer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo detectar el transportador de glucosa uno y la captación de glucosa en células inmunitarias.

No olvide que al trabajar con agentes infecciosos, deben emplearse procedimientos de seguridad estándar.