Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

El objetivo general de esta metodología es medir la absorción de glucosa y su transportador en diferentes subpoblaciones de monocitos. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la inmunología, como ¿Cuál es la importancia del metabolismo de las células inmunitarias en los resultados de la enfermedad? Las principales ventajas de estas técnicas son que son rápidas, fáciles de realizar, no requieren material reactivo y requieren solo un pequeño volumen de sangre.

Dentro de una hora después de recolectar las muestras de sangre, en tubos anticoagulantes de citrato ACD-B, coloque las muestras en una cabina de seguridad biológica. A continuación, añada 100 microlitros de sangre de cada muestra en tubos individuales de polipropileno y trate las células con dos mililitros de solución de lisado 1X en hielo, pipeteando suavemente para mezclar. Después de 15 minutos, centrifugue las células y siga con dos giros más en el tampón de lavado.

Después del segundo lavado, use una pipeta para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad posible de sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de lavado con hielo. Para identificar las subpoblaciones específicas de monocitos, tiñir las células con cinco microlitros de los anticuerpos apropiados por cada 100 microlitros de células, durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Al final de la incubación, lavar las muestras dos veces en solución de lavado y fijar las células con 200 microlitros de formaldehído al 0,5% en PBS.

A continuación, analice las células en un plazo de 24 horas en un citómetro de flujo capaz de detectar cuatro colores. Para evaluar la absorción de glucosa de las subpoblaciones de monocitos, transfiera 90 microlitros de sangre de cada muestra a tubos individuales de polipropileno y agregue 10 microlitros del análogo de glucosa fluorescente de interés a la sangre. Agite los tubos suavemente para mezclar y cubra las muestras con papel de aluminio.

Luego, coloque las celdas a 37 grados centígrados durante 15 a 30 minutos, seguido de su transferencia inmediata a hielo. A continuación, añada cuatro mililitros de solución lisante FACS a los tubos y centrifugue las células. A continuación, realice una segunda centrifugación en tampón de lavado.

Decantar el sobrenadante y teñir las células con los anticuerpos apropiados de interés durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Luego, lave las muestras en cuatro mililitros de tampón de lavado helado, vuelva a suspender los gránulos en 200 a 300 microlitros de PBS helado y analice los tubos dentro de los 10 minutos. Para el análisis de citometría de flujo, primero use las muestras de control sin teñir y teñidas individualmente para establecer la compensación.

A continuación, en el software de análisis de células individuales adecuado, abra la primera muestra en un diagrama de dispersión hacia adelante y cierre los monocitos como se ilustra. A continuación, haga doble clic en la población de monocitos cerrada y controle la población CD3 negativa. Ahora haga doble clic en la población CD3 negativa y configure el eje x para mostrar la tinción de CD14 y el eje y para mostrar la tinción de CD16.

A continuación, para medir la absorción de glucosa o su transportador en una subpoblación específica de monocitos, genere los histogramas adecuados. A continuación, cuando existan poblaciones celulares definidas, utilice las muestras de igG FITC de control para establecer la puerta y determinar el porcentaje total de monocitos CD14 positivos en cada muestra. Aquí, se muestra la estrategia inicial de compuerta para aislar los monocitos por dispersión celular y la exclusión de células T por compuerta dentro de la población CD3 negativa.

A continuación, los monocitos se activan para la expresión de CD14 solo, o en combinación con CD16 para identificar el total de monocitos o las subpoblaciones de monocitos. Se pueden observar poblaciones distintas de monocitos positivos para el transportador de glucosa Glut-1 CD14 positivo, sobre todo en los glóbulos blancos circulantes obtenidos de individuos VIH positivos. Las células Glut-1 positivas para CD14 también se pueden observar dentro de subconjuntos específicos de monocitos en individuos no infectados por el VIH, aunque estas poblaciones son más pronunciadas en los pacientes VIH positivos.

Como se esperaba de los datos de expresión del transportador de glucosa, el análogo de la glucosa 2-NBDG también es absorbido en mayores cantidades por las células de individuos VIH positivos. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una hora y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante limitar la exposición a la luz en todas las regiones.

Después de la absorción de análogos de glucosa, las células se pueden teñir con anticuerpos de superficie celular para identificar poblaciones inmunitarias específicas que le interesan. Después de su desarrollo, este método se puede utilizar para determinar cómo el VIH afecta el metabolismo de las células inmunitarias, también puede ser explorado por otros investigadores, en diferentes campos, como la inmunología, la virología y la investigación del cáncer. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar el transportador de glucosa uno y la absorción de glucosa en las células inmunitarias.

No olvide que cuando se trabaja con agentes infecciosos, se deben emplear procedimientos de seguridad estándar.