Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Este protocolo puede ayudarnos a caracterizar la respuesta inmune del huésped frente a diferentes biomateriales, lo que posteriormente puede ayudar a diseñar mejores implantes médicos futuros. La citometría de flujo nos proporciona información sobre las células inmunitarias que se infiltran en un biomaterial, lo que nos ayuda a determinar los mecanismos de cómo responden las células a las lesiones y a la implantación de materiales, así como las dianas para mejorar la terapéutica. El mismo protocolo puede modificarse para caracterizar la respuesta inmunitaria en diferentes entornos.

Diseccionar el músculo cuádruple de ratones que recibieron un implante de MEC hace una semana y se recogieron en un tubo de 50 mililitros que contenía cinco mililitros de medios libres de suero. Finalmente cortó el tejido en cubitos con unas tijeras. A continuación, agregue cinco mililitros de medios de enzimas digestivas al tubo.

Coloque el tubo que contiene los medios digestivos y los pañuelos cortados en cubitos en una incubadora agitadora durante 45 minutos a 37 grados centígrados y 100 RPM. Al final de la incubación, filtre la suspensión del tejido digerido a través de un colador de 70 micras en un tubo individual de 50 mililitros. Use un cabezal de jeringa de cinco mililitros para triturar cualquier trozo sólido de pañuelos y lave el colador con PBS a temperatura ambiente.

Deseche cualquier residuo restante en el colador y ajuste el volumen del tubo a 50 mililitros con PBS a temperatura ambiente. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en 10 mililitros de solución fría de EDTA de cinco milimolares en PBS. Si hay células sanguíneas presentes en la muestra, vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos, incube durante 10 minutos y luego agregue nueve mililitros de EDTA.

Deje la suspensión en hielo durante 10 minutos. Luego ajuste el volumen a 50 mililitros con PBS frío. Recoger las células por centrifugación y resuspender los gránulos y 100 microlitros de PBS frío.

Transfiera 10 microlitros de la suspensión a tubos de microcentrífuga individuales y mezcle con 10 microlitros de disparo y azul para contar. Dispense el volumen restante de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Retire 20 microlitros de células del pocillo y agréguelos a un nuevo pocillo para usarlos como control sin teñir.

A continuación, utilice PBS para llevar el volumen final de cada pocillo a 200 microlitros. Recoja las células en el fondo de los pocillos de placa por centrifugación y resuspenda las células en 100 microlitros de una concentración de uno a 1000 de colorante de viabilidad por pocillo. Al final de la incubación, lavar cada pocillo con 100 microlitros de PBS fresco y resuspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de tinción por pocillo.

Después de la segunda centrifugación, resuspender las células en 50 microlitros de una a 100 diluciones de bloqueador de monocitos. Incubar la suspensión celular durante cinco minutos en hielo y luego agregar 50 microlitros de cóctel de anticuerpos. Incubar durante 30 minutos en hielo protegido de la luz.

A continuación, lave los pocillos con 100 microlitros de tampón de tinción por pocillo. Centrifugar las células de nuevo y lavar con 200 microlitros de tampón de tinción. Repita el proceso dos veces más, seguido de la resuspensión de las células en 400 microlitros de tampón de tinción.

Antes de analizar la muestra, ejecute una muestra sin tinción para permitir que la población de células se ajuste en un diagrama de dispersión lateral frente a un diagrama de dispersión directa. A continuación, ejecute la muestra teñida. Extrae la firma autofluorescente.

A continuación, importe los archivos FCS para utilizarlos como control para desmezclar. Haga clic en el icono de desmezcla para abrir el asistente de desmezcla y realizar la desmezcla utilizando todos los controles de un solo color mediante la activación de las poblaciones positivas y negativas. A continuación, haga clic en la sección Control de calidad y observe el índice de complejidad.

El índice de complejidad es una medida de cuán distinguible es una colección de firmas espectrales cuando las firmas espectrales no están mezcladas. Por último, desmezcle la muestra haciendo clic en desmezclar en vivo. Aquí, se pueden observar los resultados de 14 datos de color en el tejido de ratón de control.

En este análisis, se pudieron observar varias poblaciones de grupos de presión, como los neutrófilos ly6g positivos y las clases de monocitos de expresión media y alta de ly6c. Dos células dendríticas positivas con MHC alto de CD11c fueron evidentes cuando se compararon con CD11b para descartar macrófagos y otras células de linaje mieloide como neutrófilos y monocitos. Un subconjunto de células dendríticas CD206 positivas para CD206 CD86 positivas podría identificarse centrándose en esta población CD11c positiva, que incluye tanto las células dendríticas CD86 altas como M1 y las poblaciones de células dendríticas CD206 altas como M2.

F4/80 demostró un gradiente de expresión como se observa comúnmente en varias poblaciones de macrófagos. Siglec-F estuvo presente tanto en las poblaciones positivas como negativas F4-80, muy probablemente correspondientes a un subconjunto de macrófagos y eosinófilos, respectivamente. Aunque la tinción con marcadores de superficie celular permite realizar estas designaciones de tipos de células, es importante tener en cuenta que las células que expresan diferentes marcadores deben verse de una manera funcional en lugar de una clasificación más binaria.

Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que comprender la firma autofluorescente de sus muestras poco teñidas antes de diseñar su panel es clave para lograr una mejor mezcla. Además de analizar las células, las células aisladas se pueden clasificar en poblaciones específicas para evaluaciones posteriores con ensayos celulares, análisis transcriptómicos in vitro o para análisis microscópicos para evaluar la morfología celular. La creciente complejidad de los análisis de citometría de flujo de biomateriales ayuda a cerrar la brecha entre los estudios básicos de inmunología y la ingeniería de nuevas terapias.