Un ensayo in vitro para evaluar el efecto de los anticuerpos sobre el biofilm de Candida tropicalis

Tome una microplaca que contenga el hongo Candida tropicalis.

Las células secretan Sap2, una enzima proteolítica que escinde una glicoproteína transmembrana llamada Msb2, eliminando su dominio inhibidor.

Esto induce al hongo a adherirse al fondo y convertirse en una microcolonia de levaduras y formas filamentosas. Las células secretan componentes solubles y biopolímeros, iniciando la formación de biopelículas.

Agregue una muestra de suero que contenga anticuerpos específicos de Sap2 a los pocillos seleccionados e incube en la oscuridad.

Los anticuerpos se unen a Sap2 y neutralizan su actividad, impidiendo la viabilidad celular y la maduración de la biopelícula.

En pocillos no tratados, la biopelícula madura en una densa red de células y matriz extracelular.

Aspire el líquido, lave la biopelícula y seque la placa al aire. Agregue un sustrato cromogénico e incube en la oscuridad.

Las células viables, que utilizan oxidorreductasas unidas a la membrana, reducen el sustrato a un producto coloreado.

Transfiera el sobrenadante coloreado y lea la absorbancia.

Una menor absorbancia en los pocillos tratados con suero indica la inhibición de la biopelícula mediada por anticuerpos.

Preparar diluciones en serie de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI1640 MOPS. Agregue 100 microlitros de la dilución de suero seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos.

En la columna 10, agregue solo medio RPMI1640-MOPS para el control positivo solo para hongos. Agregue una dilución de suero de 1 a 50 a todos los pocillos en la columna 11 para que sirva como control negativo sin hongos más suero. Después de cubrir el plato con una tapa y papel de aluminio, incube el plato durante 24 horas a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, después de aspirar el suero con cuidado con una pipeta multicanal, golpee suavemente la placa invertida para eliminar cualquier suero residual. Repita el lavado de PBS tres veces y seque al aire la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad biológica para secar el exceso de PBS.

Luego, disuelva 25 miligramos de XTT en 50 mililitros de lactato de Ringer esterilizado por filtro. Alícuota 10 mililitros en tubos separados. Cúbralo con papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados. A continuación, disuelva 8,6 miligramos de menadiona en 5 mililitros de acetona y, después de distribuir 50 microlitros en 100 microtubos separados, almacene las alícuotas a menos 80 grados centígrados.

Tome 10 mililitros de XTT y agregue 1 microlitro de menadiona para obtener una solución de trabajo de 1 micromolar. Agregue 100 microlitros de la solución de menadiona XTT por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Luego, después de cubrir el plato con una tapa y papel de aluminio, incube el plato durante dos horas a 37 grados centígrados en la oscuridad. Finalmente, transfiera 80 microlitros del sobrenadante coloreado de cada pocillo a una placa nueva de 96 pocillos y lea la placa a 490 nanómetros.