Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

El objetivo general de este método es evaluar la actividad de los compuestos antifúngicos potenciales, utilizando una modificación de la prueba de susceptibilidad a la microdilución del caldo, utilizada en los laboratorios clínicos. Este método se utiliza para evaluar la actividad fúngica de compuestos naturales o sintéticos, una de las primeras pruebas en el desarrollo de terapias antifúngicas. Proporcionamos instrucciones para un cribado inicial de nuevos antifúngicos utilizando pequeños volúmenes en poco tiempo, especialmente, si los experimentos se realizan con automatización.

Daniel Zamith-Miranda, becario postdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento cultivando las cepas fúngicas para el ensayo como se describe en el protocolo de texto. Al día siguiente, recoja las células centrifugando los tubos cónicos a 1200 G, durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Deseche el sobrenadante, agregue diez mililitros de PBS a cada tubo y vuelva a suspender las células. Centrifugar de nuevo a 1200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita el lavado y la centrifugación de PBS dos veces más.

Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio RPMI 1640 de doble potencia. Dependiendo de la turbidez de la suspensión celular, prepare un mililitro de una dilución de uno a 100, o de uno a 1000, de cada cepa, en un tubo de microcentrífuga. Aliquat diez microlitros de esta dilución, colóquela en una cámara de hemocitómetro y cuente el número total de células en los cuatro cuadrantes de las esquinas bajo el microscopio.

Después de calcular la densidad de cada suspensión de celda, prepare las suspensiones de celda madre en medio RPMI 1640 de doble resistencia. Prepare 4.000 células por mililitro para las cepas de C. albicans, y 20.000 células por mililitro para las cepas de C.neoformans. Los péptidos lioholizados se almacenan en aliquats de un solo uso a menos 20 grados centígrados, y solo se disuelven en agua desionizada antes de cada experimento.

La concentración de péptidos debe ser el doble de la concentración final más alta probada en el ensayo. También se preparan antifúngicos de referencia. El ensayo antifúngico se realiza en microplacas de poliestireno por triplicado y de 96 pocillos.

Utilizando una dilución seriada doble de cada péptido y antifúngico de control, y un volumen final de 50 microlitros por pocillo. El paso más crucial en el protocolo son las diluciones en serie, así que tenga mucho cuidado durante los próximos pasos para evitar cualquier error que comprometa todo su análisis. Con una pipeta, agregue 100 microlitros del péptido antifúngico en la concentración de doble fuerza de la concentración final más alta deseada en las columnas uno a tres de la fila A. Con una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros de agua estéril a los otros pocillos de las filas B a H. Retire 50 microlitros de los pocillos con la concentración más alta.

Transfiera a los pocillos correspondientes de la siguiente concentración y homogeneice pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo. Repita la dilución en serie hasta alcanzar los pocillos con la concentración más baja y deseche 50 microlitros de estos pocillos. Deje las columnas 11 y 12 de las filas A, B y C con solo agua para los controles en blanco o los controles de crecimiento negativos.

Agregue 50 microlitros del inóculo ajustado de doble fuerza en medio RPMI 1640 a cada pocillo de las columnas uno a tres, más la columna 11. La concentración final de C. albicans será de 2.000 células por mililitro. La concentración final de C. neoformans será de 10.000 células por mililitro.

Prepare controles de crecimiento negativos mezclando 50 microlitros de agua y 50 microlitros de inóculo ajustado sin el antifúngico. Prepare controles en blanco combinando 50 microlitros de agua y 50 microlitros de medio sin celdas. Cargue los controles en los pozos apropiados.

Observe todos los pocillos usando un microscopio óptico invertido y luego incube las placas a 37 grados con agitación a 200 rpm. Después del período de incubación, vuelva a observar todos los pocillos para verificar los cambios en la morfología, así como para comprobar si hay signos de contaminación. Adquiera una imagen de cada placa usando una cámara digital.

En este ensayo representativo, se evaluó la actividad antifúngica de tres péptidos antimicrobianos, o AMP, con concentraciones que oscilaban entre 100 micromolares y punto siete y ocho micromolares, para determinar la actividad antifúngica contra C. neoformans. Se incluyó un control de crecimiento y un blanco en blanco. Cualquier pozo con medios claros similares a los pozos en blanco se considera un resultado positivo, mientras que cualquier pozo con turbidez análoga a los pozos de control de crecimiento negativos se considera negativo.

Dado que la concentración mínima inhibitoria, o MIC, se define como la concentración más baja de compuestos antimicrobianos que inhibe completamente el crecimiento visible de hongos al final del período de incubación, 25 micromolares se considera la CMI para AMP1. Y, 12 coma cinco micromolares, el MIC para AMP2. El AMP3 tendrá que ser reevaluado, ya que el hongo creció en todas las concentraciones analizadas.

De la misma manera, tres péptidos distintos probados contra C.albicans, acusados de 50 micromolares es el MIC para AMP1. Seis micromolares es la CMI para AMP2 y 25 micromolares es la CMI para AMP3. Un ejemplo de un resultado deficiente, probablemente debido a un pipeteo inadecuado durante la etapa de dilución, se ilustra en las columnas cinco a siete de la fila C de esta placa, donde hay diferencias en el crecimiento de C. neoformans entre las réplicas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas, más el tiempo de crecimiento de los hongos, si se realiza correctamente. Recuerde tener en cuenta las características físico-químicas de estas moléculas probadas. A continuación, utilizar disolventes adecuados como control en caso de que sean necesarios, y utilizar siempre las células en la misma fase de crecimiento.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de muerte por tiempo, el uso de tintes de viabilidad y los ensayos ST60 para responder preguntas adicionales, como si el compuesto tiene un efecto fungicida o fungistático. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la micrología médica exploraran varias fuentes de compuestos naturales o sintéticos en la búsqueda de compuestos antifúngicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo iniciar un cultivo de hongos, preparar las células para el ensayo, realizar las diluciones en serie y leer los resultados después de incubar las cepas de hongos con nuestros compuestos probados.

No olvide que trabajar con patógenos fúngicos puede ser extremadamente peligroso. Y se deben tomar preparaciones, como el uso de equipo de protección personal, trabajar dentro de una capucha de seguridad biológica y usar las prácticas de seguridad adecuadas mientras se realiza este procedimiento.