Name: Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a evaluar compuestos antifúngicos mediante microdilución en caldo modificado, un método rápido con volúmenes pequeños que permite el cribado automatizado de agentes naturales y sintéticos contra cepas de Candida y Cryptococcus.

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Agradecemos a CAPES-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF para apoyo financiero. Agradecemos al Dr. Hugo Costa Paes para revisar el manuscrito.

1. las soluciones y los medios de comunicación
<ol><li>Preparar 2 medio de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), tamponada fosfato salino (PBS), caldo de dextrosa de Sabouraud y agar dextrosa de Sabouraud según tabla 1.</li>
</ol>2. condiciones de crecimiento del inóculo hongos
<ol><li>Guarde todas las cepas de hongos como acción congelada en 35% de glicerol a-80 ° C, hasta que se necesite.</li>
	<li>Realice los pasos siguientes antes de cada experimento.<ol>
<li>Para las cepas de Candida albicans :<ol>
<li>Descongelar un vial común y transfiera 200 μl a 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en tubo estéril 50 mL polipropileno con tapa y cultura durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación de la cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para las cepas de Cryptococcus neoformans :<ol>
<li>Raspar la superficie congelada de un frasco de stock. Las células en placas de Sabouraud dextrosa agar de la placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Tras el visible crecimiento de colonias aisladas, mantener las placas en el refrigerador (4 ° C) sellado con la película de parafina hasta 15 días.</li>
			<li>Recoger una colonia aislada de tamaño mediano de la placa con un palillo estéril o asa de inoculación estéril e inocular 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en un tubo cónico estéril 50 mL. Incuban durante aproximadamente 24 h a 30 ° C en agitación (200 rpm).</li>
			<li>No exceda la 24 h de incubación. Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación. Siempre es bueno estandarizar la fase de crecimiento de las células antes de cada prueba, ya que este es un factor importante que afecta la resistencia a los antimicrobianos. Nota: Ambos hongos fueron cultivadas a 30 ° C para la rápida propagación en nuestros experimentos, pero la temperatura puede cambiarse para reflejar los objetivos del estudio, por ejemplo tratamiento (37 ° C). Lo más importante, este tiempo de incubación inicial debe ser establecido previamente para cada hongo aislado y mantenido a lo largo de todas las pruebas para asegurar la reproducibilidad.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de crecimiento fúngico, recogen las células por centrifugación los tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS.</li>
	<li>Resuspender las células y centrifugar nuevamente a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el lavado PBS y centrifugación dos veces más. Después del tercer lavado, resuspender las células en 5 mL (según el tamaño de la pelotilla) de Medio RPMI-1640 X 2.</li>
	<li>Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 o 1:1,000 en un tubo de microcentrífuga (dependiendo de la turbidez de la suspensión de células).</li>
	<li>Alícuota de 10 μl de esta dilución, colocar en una cámara del hemocitómetro y contar el número total de células en los cuadrantes de cuatro esquinas en el microscopio. Calcular la concentración de la fórmula: (número de celular/4 en total) x dilución factor x 104 (constante de disolución de la cámara).<ol>
<li>Considerar una viabilidad del 100% si las condiciones de crecimiento y cuentas de viabilidad se han correlacionado sistemáticamente para la cepa en estudio. Nota: La normalización y control de calidad de viabilidad cuenta pueden hacerse por la parte posterior-galjanoplastia de acuerdo a la Comisión Europea de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) antimicóticos concentración inhibitoria mínima (MIC) método para levaduras10 .</li>
		<li>Si no ha sido establecida la correlación de crecimiento/viabilidad de la cepa en estudio, medir la viabilidad de hongos por recuento de células vivas en un hemocitómetro con ayuda de tintes que color selectivamente las células muertas, como la Floxina B11, trypan azul 12, o Janus verde13. Utilice las células micóticas de este protocolo sólo si la viabilidad de la población en este momento es 90% o superior. Nota: Muerto/vivo tintes no funcionen bien con el hongo de la opción. Por favor prueba antes del uso. Por ejemplo, el colorante azul de trypan no funciona bien con C. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de eso, preparar las suspensiones celulares en Medio RPMI-1640 X 2 (2 X ajustar inóculo en Medio RPMI-1640). Para placas de 96 pocillos considerar un volumen de 5 mL para cada placa.<ol>
<li>Para todas las cepas de C. albicans , preparar una suspensión stock de 4 x 103 células/mL. Esta concentración es de 2 X de la concentración final de células en cada pozo (2 x 103 células/mL).</li>
		<li>Para las cepas de C. neoformans , preparar un cultivo de células 2 x 104 células/mL. Esta concentración es dos veces la concentración final de células en cada pozo (1 x 104 células/mL).</li>
		<li>Para otros hongos, prueba con un antimicótico conocido que la concentración será ideal para el estudio particular en relación con el tiempo de incubación. Considerar con tiempo de duplicación y el metabolismo del hongo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. péptidos (agente desconocido)
<ol><li>Almacenar los péptidos liofilizados a-20 ° C y disolver en agua desionizada antes de cada experimento. El tiempo máximo de almacenamiento una vez disuelto en el agua dependerá de la naturaleza de cada péptido.</li>
	<li>Preparar alícuotas de dos veces la máxima concentración final en el ensayo (2 X). Lo ideal es preparar un pequeño número de alícuotas con suficiente péptido para un uso evitar la congelación y descongelación. Nota: La opción de concentración debe basarse en la literatura y las propiedades del péptido. Se recomienda iniciar las diluciones seriadas con aproximadamente 100 μm del péptido y disminuir o aumentar este rango de concentración dependiendo de los resultados obtenidos.</li>
</ol>4. referencia antifúngicos (controles positivos)
<ol><li>Para los diluidos en agua: preparar una solución de X 2 de la concentración más alta del análisis (ver sección 5: ensayo de antimicóticos para los pasos de dilución).<ol>
<li>Para las cepas de C. albicans , preparar una solución de 128 μg/mL de fluconazol o 128 μg/mL de la caspofungina. La concentración de placa para ambos será de 64 μg/mL.</li>
		<li>Para las cepas de C. neoformans , preparar una solución de 32 μg/mL de anfotericina B (solución soluble en agua). La concentración de placa será de 16 μg/mL. Nota: Normalmente la anfotericina B se diluye en dimetil sulfóxido (DMSO), ya que este fungicida es mal soluble en agua. Sin embargo, existen preparaciones de anfotericina B soluble en agua disponible en el mercado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para antifúngicos diluidos en un solvente orgánico: preparar 100 X solución de DMSO, luego diluir hasta 10 X en agua para su uso. Nota: Por lo tanto, en el pozo, la concentración final de DMSO no superará el 1%. Un pozo donde el hongo crece en medios que contienen 1% DMSO como control es necesario ya que algunos hongos lo toleran bien esta concentración del disolvente. Recuerde que el DMSO es fotosensible, así que cubra la placa con papel de aluminio o colocarlo en una cámara oscura para la duración de la incubación.</li>
</ol>5. ensayo antimicótico
Nota: In vitro antifúngicos ensayos se realizan en base a la prueba de sensibilidad de microdilución caldo de guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con algunas modificaciones.
<ol><li>Preparar una dilución seriada de la dobles de cada péptido y antihongos en microplacas de poliestireno de 96 pocillos a un volumen final de 50 μl de control.<ol>
<li>Añadir con una pipeta 100 μl del péptido y antimicótico en la concentración de X 2 de la más alta deseada concentración final en las columnas 1-3, en fila A.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de agua estéril en los pozos, en filas B a H.</li>
		<li>Quitar 50 μl de los pozos con la concentración más alta (columna A), transferencia a la siguiente también de la concentración próxima (fila B) y homogeneizar.</li>
		<li>Repita los pasos anteriores hasta el pozo con la concentración más baja y descartar 50 μl de este pozo (columna H). Dejar columnas 11 y 12 (filas A, B, C) con sólo agua para control de crecimiento negativo o control en blanco.</li>
		<li>Añadir 50 μl de la 2 X inóculo ajustado en Medio RPMI-1640 a cada pozo (columnas 1-3 más columna 11 (control de crecimiento negativo)); la concentración final para C. albicans será 2 x 103 células/mL y la concentración final para las cepas de C. neoformans 104 células/mL.</li>
		<li>Preparar controles en blanco (50 μl de agua + 50 μl de 2 X RPMI-1640 medio sin células) y control de crecimiento negativo (50 μl de agua + 50 μl ajustar inóculo 2 X RPMI-1640 medio sin antifúngico) y carga en la placa bien y como se describe arriba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el procedimiento para cada compuesto ser probados y el control elegido antihongos (columnas 4-10). Nota: Las diluciones seriadas pueden hacerse verticalmente como el experimento de abajo, u horizontal en la placa (es decir, si el número de diluciones de determinado compuesto/extracto que debe probarse es ocho o más).<ol>
<li>Si los compuestos de referencia medicamentos, o cualquiera de sus componentes son fotosensibles, realizar el análisis de luz reducida, cubrir las placas con papel de aluminio o colocar en una cámara oscura durante las incubaciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considere las siguientes recomendaciones opcionales.<ol>
<li>Selle la placa con una plancha de cubierta transparente que permite el intercambio de gases, como esta ayuda a reduce la evaporación.</li>
		<li>Colocar la placa en una cámara húmeda; también ayudará a reducir la evaporación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h o 48 h para todas las cepas de C. albicans y durante 48 h con 200 rpm por C. neoformans. El menor volumen final (100 μL) asegura que no hay derrame ocurre. Nota: Ninguna diferencia significativa se observó entre MIC lecturas a las 24 h y 48 h para las cepas de C. albicans . Sin embargo, las lecturas a las 48 h son más fáciles de visualizar.</li>
	<li>Observar todos los pozos, con la ayuda de un microscopio óptico invertido, antes de la incubación y después de verificar cambios en la morfología, así como para verificar si hay signos de contaminación. Nota: Lecturas pueden hacerse visualmente y fotografiadas en el final del experimento. Antes de cada lectura, homogeneizar un poco la placa. Las lecturas también se pueden realizar mediante la medición de su OD a 600 nm, si la célula produce o filamentación no se observan.</li>
	<li>Realizar los experimentos al menos tres veces en diferentes fechas.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
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<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pruebas de microdilución pueden analizar la potencial actividad antifúngica de un objetivo compuesto usando pequeñas cantidades del compuesto y al mismo tiempo la prueba en una gama de concentraciones. Por consiguiente, este protocolo se recomienda como primer paso en la detección de posibles nuevos compuestos antifúngicos. El protocolo presentado aquí se basa en el protocolo M27-A3, inicialmente diseñado para ayudar en la selección de la terapia antifúngica en clínicas y puede ser adaptado a una variedad de nuevos compu...

Infecciones por hongos se han convertido en una preocupación médica importante en las últimas décadas, habiendo aumentado considerablemente debido principalmente a un aumento en el número de individuos inmunocomprometidos como los sometidos a tratamiento contra el cáncer y las personas que viven con VIH/SIDA o trasplantados de órganos1,2. Sin embargo, una gama muy limitada de los fármacos antimicóticos disponibles y el número creciente de informes sobre resistencia a los hongos les contribuyen a los grandes problemas con respecto a la terapéutica de micosis sistémicas3.
Una fuente potencial de nuevos compuestos antimicóticos son péptidos antimicrobianos (AMPs), pequeños péptidos catiónicos producidos por muchos organismos como parte de la respuesta inmune innata a infecciones4. Sin embargo, no está estandarizado el método de cribado para probar estos compuestos contra hongos patógenos. Se han utilizado diversos procedimientos para evaluar la actividad antifúngica de amperios, a veces para el mismo modelo microorganismo5,6,7. Estas diferencias y la falta de detalle en algunos de los protocolos complican las comparaciones entre reproducibilidad compuestos y cestas.
Una manera de estandarizar las pruebas de nuevos fármacos candidatos debe seguir directrices utilizadas para definir susceptibilidad antifúngica en contextos clínicos, como la clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3. Sin embargo, estas pruebas de sensibilidad a los antifúngicos son demasiado restrictivas y no tienen en variaciones de consideración en el metabolismo entre especies, ya que sólo se establecieron algunos agentes selectos. Por ejemplo, no toman en cuenta las necesidades metabólicas de las levaduras no fermentadores.
Este protocolo permite la evaluación de la actividad de potenciales compuestos antihongos y se implementa aquí para la búsqueda de péptidos antifúngicos. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las directrices del CLSI M27-A3 con modificaciones que optimizan la proyección de nuevos compuestos de8,9. Estos cambios permiten el uso de pequeñas cantidades de compuesto, las variaciones de temperatura o inóculo inicial y distintos medios para un crecimiento óptimo previo a la prueba, mientras que la estandarización de los resultados con el uso de antifúngicos de referencia como controles. Este método, con la utilización de placas de varios pocillos cultura, permite la rápida y confiable de la pantalla un gran número de compuestos.
Debido a su flexibilidad inherente, este protocolo puede utilizarse con diferentes clases químicas de los compuestos y contra otros microorganismos, con pocas adaptaciones.

<table><tbody><tr><td><fuerte>medios y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio con l-glutamina, sin bicarbonato de sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) propano ácido sulfónico (MOPS) (o que a gente usa tem mmm s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Úselo para amortiguar el medio 2X RPMI</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Din&acirc; mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Fosfato sódico dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud caldo de dextrosa</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Agar Dextrosa</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% para (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> estéril <td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td><fuerte>Medicamentos antifúngicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Plásticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo</td> <td>cónicoSarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de solución estéril</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Úselo para pipetear las soluciones utilizando el pippet multicanal</td></tr><tr><td>Equipment y otros materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Ajustado a 37&deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Ajustado a 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células, Neubauer</td><td>BOECO Alemania</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

microdilución en vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Infecciones por hongos se han convertido en una condición médica importante en las últimas décadas, pero el número de fármacos antifúngicos disponibles es limitado. En este escenario, la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos es necesaria. El protocolo reportado aquí detalla un método para péptidos de pantalla por sus propiedades antifúngicas. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con modificaciones para adaptarse a la investigación de péptidos antimicrobianos como potenciales nuevos antifúngicos. Este protocolo describe un análisis funcional para evaluar la actividad de compuestos antimicóticos y puede modificarse fácilmente para adaptarse a cualquier clase particular de moléculas bajo investigación. Puesto que los ensayos se realizan en placas de 96 pozos utilizando pequeños volúmenes, una proyección a gran escala puede completarse en un corto período de tiempo, especialmente si lleva a cabo en un entorno de automatización. Este procedimiento muestra cómo un protocolo clínico estandarizado y ajustable puede ayudar a la búsqueda Banco de trabajo de nuevas moléculas para mejorar la terapia de enfermedades causadas por hongos.

La CMI se define como la menor concentración compuesta antimicrobiana que inhibe totalmente visible crecimiento del hongo al final de la incubación. Puesto que el objetivo de este protocolo es tener un método rápido de antifúngicos potencial pantalla, cualquier pozo con claros medios similares a los pocillos del blanco se considera un resultado positivo, considerando que cualquier pozo con turbiedad análogo a los pocillos de control de crecimiento negativo es considera negativo. Sin embar...

Un método microdilución en caldo fácil y adaptable para la detección de compuestos antifúngicos y extractos.

Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

El objetivo general de este método es evaluar la actividad de los compuestos antifúngicos potenciales, utilizando una modificación de la prueba de susceptibilidad a la microdilución del caldo, utilizada en los laboratorios clínicos. Este método se utiliza para evaluar la actividad fúngica de compuestos naturales o sintéticos, una de las primeras pruebas en el desarrollo de terapias antifúngicas. Proporcionamos instrucciones para un cribado inicial de nuevos antifúngicos utilizando pequeños volúmenes en poco tiempo, especialmente, si los experimentos se realizan con automatización.Daniel Zamith-Miranda, becario postdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento cultivando las cepas fúngicas para el ensayo como se describe en el protocolo de texto. Al día siguiente, recoja las células centrifugando los tubos cónicos a 1200 G, durante cinco minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante, agregue diez mililitros de PBS a cada tubo y vuelva a suspender las células. Centrifugar de nuevo a 1200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita el lavado y la centrifugación de PBS dos veces más.Después del tercer lavado, vuelva a suspender

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Investigación

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Biology

Biología

Se describe un método simple, rápido y robusto para la formación...

A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

Hemos desarrollado una plataforma de microarrays de alta densidad que consiste en 3D nano-biopelículas...

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Fuente: Koeth, L. M., et. al., Un método de microdilución de caldo de referencia para pruebas de susceptibilidad in vitro a dalbavancina de bacterias que crecen aeróbicamente. J. Vis. Exp. (2015).Este video demuestra el método de microdilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico lipoglicopéptido contra bacterias grampositivas. Cubre el aislamiento de colonias bacterianas, la dilución, la inoculación de pocillos de microplacas con diferentes...

Un método de microdilución en caldo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias grampositivas

Este video muestra un ensayo in vitro para detectar compuestos antifúngicos utilizando un ensayo de microdilución de caldo. Los compuestos de prueba se diluyen en serie en una placa de microtitulación y se incuban con un inóculo fúngico. Después de la incubación, se examina la placa en busca de pocillos sin crecimiento fúngico visible para evaluar el potencial antifúngico de los compuestos de prueba y su concentración inhibitoria mínima (CMI).

Un ensayo de microdilución de caldo in vitro para el cribado de compuestos antifúngicos

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de la susceptibilidad a la dalbavancina de bacterias Gram-positivas clínicamente relevantes utilizando una metodología de referencia de microdilución de caldo.

Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.

Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

En el presente documento se describe un protocolo basado en placas de microtitulación de 96 pocillos que utiliza un ensayo de reducción de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT), para estudiar los efectos de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en...

Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de Candida tropicalis

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Aprende a evaluar compuestos antifúngicos mediante microdilución en caldo modificado, un método rápido con volúmenes pequeños que permite el cribado automatizado de agentes naturales y sintéticos contra cepas de Candida y Cryptococcus.

Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

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