Name: Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a evaluar compuestos antifúngicos mediante microdilución en caldo modificado, un método rápido con volúmenes pequeños que permite el cribado automatizado de agentes naturales y sintéticos contra cepas de Candida y Cryptococcus.

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Agradecemos a CAPES-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF para apoyo financiero. Agradecemos al Dr. Hugo Costa Paes para revisar el manuscrito.

1. las soluciones y los medios de comunicación
<ol><li>Preparar 2 medio de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), tamponada fosfato salino (PBS), caldo de dextrosa de Sabouraud y agar dextrosa de Sabouraud según tabla 1.</li>
</ol>2. condiciones de crecimiento del inóculo hongos
<ol><li>Guarde todas las cepas de hongos como acción congelada en 35% de glicerol a-80 ° C, hasta que se necesite.</li>
	<li>Realice los pasos siguientes antes de cada experimento.<ol>
<li>Para las cepas de Candida albicans :<ol>
<li>Descongelar un vial común y transfiera 200 μl a 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en tubo estéril 50 mL polipropileno con tapa y cultura durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación de la cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para las cepas de Cryptococcus neoformans :<ol>
<li>Raspar la superficie congelada de un frasco de stock. Las células en placas de Sabouraud dextrosa agar de la placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Tras el visible crecimiento de colonias aisladas, mantener las placas en el refrigerador (4 ° C) sellado con la película de parafina hasta 15 días.</li>
			<li>Recoger una colonia aislada de tamaño mediano de la placa con un palillo estéril o asa de inoculación estéril e inocular 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en un tubo cónico estéril 50 mL. Incuban durante aproximadamente 24 h a 30 ° C en agitación (200 rpm).</li>
			<li>No exceda la 24 h de incubación. Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación. Siempre es bueno estandarizar la fase de crecimiento de las células antes de cada prueba, ya que este es un factor importante que afecta la resistencia a los antimicrobianos. Nota: Ambos hongos fueron cultivadas a 30 ° C para la rápida propagación en nuestros experimentos, pero la temperatura puede cambiarse para reflejar los objetivos del estudio, por ejemplo tratamiento (37 ° C). Lo más importante, este tiempo de incubación inicial debe ser establecido previamente para cada hongo aislado y mantenido a lo largo de todas las pruebas para asegurar la reproducibilidad.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de crecimiento fúngico, recogen las células por centrifugación los tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS.</li>
	<li>Resuspender las células y centrifugar nuevamente a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el lavado PBS y centrifugación dos veces más. Después del tercer lavado, resuspender las células en 5 mL (según el tamaño de la pelotilla) de Medio RPMI-1640 X 2.</li>
	<li>Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 o 1:1,000 en un tubo de microcentrífuga (dependiendo de la turbidez de la suspensión de células).</li>
	<li>Alícuota de 10 μl de esta dilución, colocar en una cámara del hemocitómetro y contar el número total de células en los cuadrantes de cuatro esquinas en el microscopio. Calcular la concentración de la fórmula: (número de celular/4 en total) x dilución factor x 104 (constante de disolución de la cámara).<ol>
<li>Considerar una viabilidad del 100% si las condiciones de crecimiento y cuentas de viabilidad se han correlacionado sistemáticamente para la cepa en estudio. Nota: La normalización y control de calidad de viabilidad cuenta pueden hacerse por la parte posterior-galjanoplastia de acuerdo a la Comisión Europea de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) antimicóticos concentración inhibitoria mínima (MIC) método para levaduras10 .</li>
		<li>Si no ha sido establecida la correlación de crecimiento/viabilidad de la cepa en estudio, medir la viabilidad de hongos por recuento de células vivas en un hemocitómetro con ayuda de tintes que color selectivamente las células muertas, como la Floxina B11, trypan azul 12, o Janus verde13. Utilice las células micóticas de este protocolo sólo si la viabilidad de la población en este momento es 90% o superior. Nota: Muerto/vivo tintes no funcionen bien con el hongo de la opción. Por favor prueba antes del uso. Por ejemplo, el colorante azul de trypan no funciona bien con C. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de eso, preparar las suspensiones celulares en Medio RPMI-1640 X 2 (2 X ajustar inóculo en Medio RPMI-1640). Para placas de 96 pocillos considerar un volumen de 5 mL para cada placa.<ol>
<li>Para todas las cepas de C. albicans , preparar una suspensión stock de 4 x 103 células/mL. Esta concentración es de 2 X de la concentración final de células en cada pozo (2 x 103 células/mL).</li>
		<li>Para las cepas de C. neoformans , preparar un cultivo de células 2 x 104 células/mL. Esta concentración es dos veces la concentración final de células en cada pozo (1 x 104 células/mL).</li>
		<li>Para otros hongos, prueba con un antimicótico conocido que la concentración será ideal para el estudio particular en relación con el tiempo de incubación. Considerar con tiempo de duplicación y el metabolismo del hongo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. péptidos (agente desconocido)
<ol><li>Almacenar los péptidos liofilizados a-20 ° C y disolver en agua desionizada antes de cada experimento. El tiempo máximo de almacenamiento una vez disuelto en el agua dependerá de la naturaleza de cada péptido.</li>
	<li>Preparar alícuotas de dos veces la máxima concentración final en el ensayo (2 X). Lo ideal es preparar un pequeño número de alícuotas con suficiente péptido para un uso evitar la congelación y descongelación. Nota: La opción de concentración debe basarse en la literatura y las propiedades del péptido. Se recomienda iniciar las diluciones seriadas con aproximadamente 100 μm del péptido y disminuir o aumentar este rango de concentración dependiendo de los resultados obtenidos.</li>
</ol>4. referencia antifúngicos (controles positivos)
<ol><li>Para los diluidos en agua: preparar una solución de X 2 de la concentración más alta del análisis (ver sección 5: ensayo de antimicóticos para los pasos de dilución).<ol>
<li>Para las cepas de C. albicans , preparar una solución de 128 μg/mL de fluconazol o 128 μg/mL de la caspofungina. La concentración de placa para ambos será de 64 μg/mL.</li>
		<li>Para las cepas de C. neoformans , preparar una solución de 32 μg/mL de anfotericina B (solución soluble en agua). La concentración de placa será de 16 μg/mL. Nota: Normalmente la anfotericina B se diluye en dimetil sulfóxido (DMSO), ya que este fungicida es mal soluble en agua. Sin embargo, existen preparaciones de anfotericina B soluble en agua disponible en el mercado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para antifúngicos diluidos en un solvente orgánico: preparar 100 X solución de DMSO, luego diluir hasta 10 X en agua para su uso. Nota: Por lo tanto, en el pozo, la concentración final de DMSO no superará el 1%. Un pozo donde el hongo crece en medios que contienen 1% DMSO como control es necesario ya que algunos hongos lo toleran bien esta concentración del disolvente. Recuerde que el DMSO es fotosensible, así que cubra la placa con papel de aluminio o colocarlo en una cámara oscura para la duración de la incubación.</li>
</ol>5. ensayo antimicótico
Nota: In vitro antifúngicos ensayos se realizan en base a la prueba de sensibilidad de microdilución caldo de guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con algunas modificaciones.
<ol><li>Preparar una dilución seriada de la dobles de cada péptido y antihongos en microplacas de poliestireno de 96 pocillos a un volumen final de 50 μl de control.<ol>
<li>Añadir con una pipeta 100 μl del péptido y antimicótico en la concentración de X 2 de la más alta deseada concentración final en las columnas 1-3, en fila A.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de agua estéril en los pozos, en filas B a H.</li>
		<li>Quitar 50 μl de los pozos con la concentración más alta (columna A), transferencia a la siguiente también de la concentración próxima (fila B) y homogeneizar.</li>
		<li>Repita los pasos anteriores hasta el pozo con la concentración más baja y descartar 50 μl de este pozo (columna H). Dejar columnas 11 y 12 (filas A, B, C) con sólo agua para control de crecimiento negativo o control en blanco.</li>
		<li>Añadir 50 μl de la 2 X inóculo ajustado en Medio RPMI-1640 a cada pozo (columnas 1-3 más columna 11 (control de crecimiento negativo)); la concentración final para C. albicans será 2 x 103 células/mL y la concentración final para las cepas de C. neoformans 104 células/mL.</li>
		<li>Preparar controles en blanco (50 μl de agua + 50 μl de 2 X RPMI-1640 medio sin células) y control de crecimiento negativo (50 μl de agua + 50 μl ajustar inóculo 2 X RPMI-1640 medio sin antifúngico) y carga en la placa bien y como se describe arriba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el procedimiento para cada compuesto ser probados y el control elegido antihongos (columnas 4-10). Nota: Las diluciones seriadas pueden hacerse verticalmente como el experimento de abajo, u horizontal en la placa (es decir, si el número de diluciones de determinado compuesto/extracto que debe probarse es ocho o más).<ol>
<li>Si los compuestos de referencia medicamentos, o cualquiera de sus componentes son fotosensibles, realizar el análisis de luz reducida, cubrir las placas con papel de aluminio o colocar en una cámara oscura durante las incubaciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considere las siguientes recomendaciones opcionales.<ol>
<li>Selle la placa con una plancha de cubierta transparente que permite el intercambio de gases, como esta ayuda a reduce la evaporación.</li>
		<li>Colocar la placa en una cámara húmeda; también ayudará a reducir la evaporación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h o 48 h para todas las cepas de C. albicans y durante 48 h con 200 rpm por C. neoformans. El menor volumen final (100 μL) asegura que no hay derrame ocurre. Nota: Ninguna diferencia significativa se observó entre MIC lecturas a las 24 h y 48 h para las cepas de C. albicans . Sin embargo, las lecturas a las 48 h son más fáciles de visualizar.</li>
	<li>Observar todos los pozos, con la ayuda de un microscopio óptico invertido, antes de la incubación y después de verificar cambios en la morfología, así como para verificar si hay signos de contaminación. Nota: Lecturas pueden hacerse visualmente y fotografiadas en el final del experimento. Antes de cada lectura, homogeneizar un poco la placa. Las lecturas también se pueden realizar mediante la medición de su OD a 600 nm, si la célula produce o filamentación no se observan.</li>
	<li>Realizar los experimentos al menos tres veces en diferentes fechas.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
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<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pruebas de microdilución pueden analizar la potencial actividad antifúngica de un objetivo compuesto usando pequeñas cantidades del compuesto y al mismo tiempo la prueba en una gama de concentraciones. Por consiguiente, este protocolo se recomienda como primer paso en la detección de posibles nuevos compuestos antifúngicos. El protocolo presentado aquí se basa en el protocolo M27-A3, inicialmente diseñado para ayudar en la selección de la terapia antifúngica en clínicas y puede ser adaptado a una variedad de nuevos compu...

Infecciones por hongos se han convertido en una preocupación médica importante en las últimas décadas, habiendo aumentado considerablemente debido principalmente a un aumento en el número de individuos inmunocomprometidos como los sometidos a tratamiento contra el cáncer y las personas que viven con VIH/SIDA o trasplantados de órganos1,2. Sin embargo, una gama muy limitada de los fármacos antimicóticos disponibles y el número creciente de informes sobre resistencia a los hongos les contribuyen a los grandes problemas con respecto a la terapéutica de micosis sistémicas3.
Una fuente potencial de nuevos compuestos antimicóticos son péptidos antimicrobianos (AMPs), pequeños péptidos catiónicos producidos por muchos organismos como parte de la respuesta inmune innata a infecciones4. Sin embargo, no está estandarizado el método de cribado para probar estos compuestos contra hongos patógenos. Se han utilizado diversos procedimientos para evaluar la actividad antifúngica de amperios, a veces para el mismo modelo microorganismo5,6,7. Estas diferencias y la falta de detalle en algunos de los protocolos complican las comparaciones entre reproducibilidad compuestos y cestas.
Una manera de estandarizar las pruebas de nuevos fármacos candidatos debe seguir directrices utilizadas para definir susceptibilidad antifúngica en contextos clínicos, como la clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3. Sin embargo, estas pruebas de sensibilidad a los antifúngicos son demasiado restrictivas y no tienen en variaciones de consideración en el metabolismo entre especies, ya que sólo se establecieron algunos agentes selectos. Por ejemplo, no toman en cuenta las necesidades metabólicas de las levaduras no fermentadores.
Este protocolo permite la evaluación de la actividad de potenciales compuestos antihongos y se implementa aquí para la búsqueda de péptidos antifúngicos. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las directrices del CLSI M27-A3 con modificaciones que optimizan la proyección de nuevos compuestos de8,9. Estos cambios permiten el uso de pequeñas cantidades de compuesto, las variaciones de temperatura o inóculo inicial y distintos medios para un crecimiento óptimo previo a la prueba, mientras que la estandarización de los resultados con el uso de antifúngicos de referencia como controles. Este método, con la utilización de placas de varios pocillos cultura, permite la rápida y confiable de la pantalla un gran número de compuestos.
Debido a su flexibilidad inherente, este protocolo puede utilizarse con diferentes clases químicas de los compuestos y contra otros microorganismos, con pocas adaptaciones.

<table><tbody><tr><td><fuerte>medios y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio con l-glutamina, sin bicarbonato de sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) propano ácido sulfónico (MOPS) (o que a gente usa tem mmm s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Úselo para amortiguar el medio 2X RPMI</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Din&acirc; mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Fosfato sódico dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud caldo de dextrosa</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Agar Dextrosa</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% para (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> estéril <td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td><fuerte>Medicamentos antifúngicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Plásticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo</td> <td>cónicoSarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de solución estéril</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Úselo para pipetear las soluciones utilizando el pippet multicanal</td></tr><tr><td>Equipment y otros materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Ajustado a 37&deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Ajustado a 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células, Neubauer</td><td>BOECO Alemania</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

microdilución en vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Infecciones por hongos se han convertido en una condición médica importante en las últimas décadas, pero el número de fármacos antifúngicos disponibles es limitado. En este escenario, la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos es necesaria. El protocolo reportado aquí detalla un método para péptidos de pantalla por sus propiedades antifúngicas. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con modificaciones para adaptarse a la investigación de péptidos antimicrobianos como potenciales nuevos antifúngicos. Este protocolo describe un análisis funcional para evaluar la actividad de compuestos antimicóticos y puede modificarse fácilmente para adaptarse a cualquier clase particular de moléculas bajo investigación. Puesto que los ensayos se realizan en placas de 96 pozos utilizando pequeños volúmenes, una proyección a gran escala puede completarse en un corto período de tiempo, especialmente si lleva a cabo en un entorno de automatización. Este procedimiento muestra cómo un protocolo clínico estandarizado y ajustable puede ayudar a la búsqueda Banco de trabajo de nuevas moléculas para mejorar la terapia de enfermedades causadas por hongos.

La CMI se define como la menor concentración compuesta antimicrobiana que inhibe totalmente visible crecimiento del hongo al final de la incubación. Puesto que el objetivo de este protocolo es tener un método rápido de antifúngicos potencial pantalla, cualquier pozo con claros medios similares a los pocillos del blanco se considera un resultado positivo, considerando que cualquier pozo con turbiedad análogo a los pocillos de control de crecimiento negativo es considera negativo. Sin embar...

Un método microdilución en caldo fácil y adaptable para la detección de compuestos antifúngicos y extractos.

Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

El objetivo general de este método es evaluar la actividad de los compuestos antifúngicos potenciales, utilizando una modificación de la prueba de susceptibilidad a la microdilución del caldo, utilizada en los laboratorios clínicos. Este método se utiliza para evaluar la actividad fúngica de compuestos naturales o sintéticos, una de las primeras pruebas en el desarrollo de terapias antifúngicas. Proporcionamos instrucciones para un cribado inicial de nuevos antifúngicos utilizando pequeños volúmenes en poco tiempo, especialmente, si los experimentos se realizan con automatización.Daniel Zamith-Miranda, becario postdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento cultivando las cepas fúngicas para el ensayo como se describe en el protocolo de texto. Al día siguiente, recoja las células centrifugando los tubos cónicos a 1200 G, durante cinco minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante, agregue diez mililitros de PBS a cada tubo y vuelva a suspender las células. Centrifugar de nuevo a 1200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita el lavado y la centrifugación de PBS dos veces más.Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio RPMI 1640 de doble potencia. Dependiendo de la turbidez de la suspensión celular, prepare un mililitro de una dilución de uno a 100, o de uno a 1000, de cada cepa, en un tubo de microcentrífuga. Aliquat diez microlitros de esta dilución, colóquela en una cámara de hemocitómetro y cuente el número total de células en los cuatro cuadrantes de las esquinas bajo el microscopio.Después de calcular la densidad de cada suspensión de celda, prepare las suspensiones de celda madre en medio RPMI 1640 de doble resistencia. Prepare 4.000 células por mililitro para las cepas de C. albicans, y 20.000 células por mililitro para las cepas de C.neoformans. Los péptidos lioholizados se almacenan en aliquats de un solo uso a menos 20 grados centígrados, y solo se disuelven en agua desionizada antes de cada experimento.La concentración de péptidos debe ser el doble de la concentración final más alta probada en el ensayo. También se preparan antifúngicos de referencia. El ensayo antifúngico se realiza en microplacas de poliestireno por triplicado y de 96 pocillos.Utilizando una dilución seriada doble de cada péptido y antifúngico de control, y un volumen final de 50 microlitros por pocillo. El paso más crucial en el protocolo son las diluciones en serie, así que tenga mucho cuidado durante los próximos pasos para evitar cualquier error que comprometa todo su análisis. Con una pipeta, agregue 100 microlitros del péptido antifúngico en la concentración de doble fuerza de la concentración final más alta deseada en las columnas uno a tres de la fila A. Con una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros de agua estéril a los otros pocillos de las filas B a H. Retire 50 microlitros de los pocillos con la concentración más alta.Transfiera a los pocillos correspondientes de la siguiente concentración y homogeneice pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo. Repita la dilución en serie hasta alcanzar los pocillos con la concentración más baja y deseche 50 microlitros de estos pocillos. Deje las columnas 11 y 12 de las filas A, B y C con solo agua para los controles en blanco o los controles de crecimiento negativos.Agregue 50 microlitros del inóculo ajustado de doble fuerza en medio RPMI 1640 a cada pocillo de las columnas uno a tres, más la columna 11. La concentración final de C. albicans será de 2.000 células por mililitro. La concentración final de C. neoformans será de 10.000 células por mililitro.Prepare controles de crecimiento negativos mezclando 50 microlitros de agua y 50 microlitros de inóculo ajustado sin el antifúngico. Prepare controles en blanco combinando 50 microlitros de agua y 50 microlitros de medio sin celdas. Cargue los controles en los pozos apropiados.Observe todos los pocillos usando un microscopio óptico invertido y luego incube las placas a 37 grados con agitación a 200 rpm. Después del período de incubación, vuelva a observar todos los pocillos para verificar los cambios en la morfología, así como para comprobar si hay signos de contaminación. Adquiera una imagen de cada placa usando una cámara digital.En este ensayo representativo, se evaluó la actividad antifúngica de tres péptidos antimicrobianos, o AMP, con concentraciones que oscilaban entre 100 micromolares y punto siete y ocho micromolares, para determinar la actividad antifúngica contra C. neoformans. Se incluyó un control de crecimiento y un blanco en blanco. Cualquier pozo con medios claros similares a los pozos en blanco se considera un resultado positivo, mientras que cualquier pozo con turbidez análoga a los pozos de control de crecimiento negativos se considera negativo.Dado que la concentración mínima inhibitoria, o MIC, se define como la concentración más baja de compuestos antimicrobianos que inhibe completamente el crecimiento visible de hongos al final del período de incubación, 25 micromolares se considera la CMI para AMP1. Y, 12 coma cinco micromolares, el MIC para AMP2. El AMP3 tendrá que ser reevaluado, ya que el hongo creció en todas las concentraciones analizadas.De la misma manera, tres péptidos distintos probados contra C.albicans, acusados de 50 micromolares es el MIC para AMP1. Seis micromolares es la CMI para AMP2 y 25 micromolares es la CMI para AMP3. Un ejemplo de un resultado deficiente, probablemente debido a un pipeteo inadecuado durante la etapa de dilución, se ilustra en las columnas cinco a siete de la fila C de esta placa, donde hay diferencias en el crecimiento de C. neoformans entre las réplicas.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas, más el tiempo de crecimiento de los hongos, si se realiza correctamente. Recuerde tener en cuenta las características físico-químicas de estas moléculas probadas. A continuación, utilizar disolventes adecuados como control en caso de que sean necesarios, y utilizar siempre las células en la misma fase de crecimiento.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de muerte por tiempo, el uso de tintes de viabilidad y los ensayos ST60 para responder preguntas adicionales, como si el compuesto tiene un efecto fungicida o fungistático. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la micrología médica exploraran varias fuentes de compuestos naturales o sintéticos en la búsqueda de compuestos antifúngicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo iniciar un cultivo de hongos, preparar las células para el ensayo, realizar las diluciones en serie y leer los resultados después de incubar las cepas de hongos con nuestros compuestos probados.No olvide que trabajar con patógenos fúngicos puede ser extremadamente peligroso. Y se deben tomar preparaciones, como el uso de equipo de protección personal, trabajar dentro de una capucha de seguridad biológica y usar las prácticas de seguridad adecuadas mientras se realiza este procedimiento.

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