Análisis basado en citometría de flujo de la activación de células dendríticas mediante complejos inmunitarios

Comience con una suspensión de células tumorales fijada químicamente.

Agregue una concentración óptima de inmunoglobulina G de unión tumoral que se une a los antígenos de la superficie de las células tumorales, formando complejos inmunes o IC.

Transfiera los CI a una placa de cultivo que contenga células dendríticas adheridas. Incubar.

La célula dendrítica reconoce el CI, lo internaliza y lo procesa en fragmentos peptídicos.

Los fragmentos se cargan en moléculas principales del complejo de histocompatibilidad de clase II o MHC-II y se presentan en la superficie celular, junto con la molécula coestimuladora CD86.

Retire los medios. Agregue un tampón de disociación celular y pipetee vigorosamente para separar las células.

Transfiera las células a un tubo.

Centrifugar y resuspender las células en una solución de bloqueo para bloquear interacciones no específicas.

Superposición con un cóctel de anticuerpos marcado con fluoróforo dirigido a MHC-II y CD86.

Agregue un tinte de unión al ADN e incube brevemente para teñir los núcleos de células muertas.

Mediante citometría de flujo, identifique las células vivas que coexpresan MHC-II y CD86, confirmando la activación de células dendríticas mediada por IC.

Primero, fije las células en paraformaldehído tamponado al 1,8% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Siembre la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de U. A continuación, agregue diluciones variables de anticuerpos de unión tumoral en cada pocillo. A continuación, incube las células en hielo durante 15 a 20 minutos.

Después de la incubación, lave las células con 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato, luego centrifugue a 400 veces g durante 5 a 10 minutos a 4 grados centígrados. Después de la centrifugación, expulse el sobrenadante y lave las células dos veces. Disuelva las células en 100 microlitros de tampón FACS, que contiene anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo. Luego, incube el plato en hielo durante 15 a 20 minutos.

Después de 15 a 20 minutos, agregue 200 microlitros de tampón FACS para lavar las células. Centrifugar la placa a 400 veces g durante 5 a 10 minutos. Decantar el sobrenadante. Realizar citometría de flujo para analizar la unión tumoral y determinar la concentración mínima de inmunoglobulina G necesaria para recubrir las células.

Una vez que las células estén recubiertas con una concentración mínima de inmunoglobulina G, agregue el complejo inmune tumoral marcado con CFSE a las células dendríticas derivadas de monocitos en una proporción de 1: 5. Luego, incube la mezcla durante 12 a 16 horas durante la noche en medio completo. Realizar análisis FACS de la activación de células dendríticas derivadas de monocitos.