Registro de la actividad electrofisiológica de la red neuronal en un cocultivo neurona-astrocito

Comience con una placa de matriz de electrodos múltiples, o MEA. Cada pocillo contiene una matriz de electrodos colocada en el centro.

La matriz está recubierta con un sustrato de cultivo para facilitar la adhesión celular.

Agregue una suspensión de neuronas motoras y astrocitos como una gota sobre la matriz.

Incube para permitir la unión celular, luego agregue un medio de cocultivo tibio complementado con una molécula pequeña que mantenga la viabilidad celular.

Durante la incubación, los astrocitos secretan factores que promueven la maduración neuronal y la formación de sinapsis, lo que da como resultado una red neuronal.

Coloque el MEA en un dispositivo de registro en condiciones fisiológicas para monitorear la actividad neuronal.

Las neuronas transmiten señales eléctricas, llamadas potenciales de acción, que viajan a lo largo de sus axones.

Al llegar a la sinapsis, la señal desencadena la liberación de neurotransmisores, propagando la señal a la siguiente neurona.

Los electrodos dentro de cada pocillo registran extracelularmente las señales generadas por las neuronas conectadas sinápticamente.

La detección de señales eléctricas rítmicas sincronizadas confirma el establecimiento de una red neuronal.

El día del recubrimiento o antes, comience a recubrir las placas MEA de 24 pocillos diluyendo primero el PLO en agua o PBS. Luego, agregue de 15 a 20 microlitros de PLO a cada pocillo, formando una gota en el centro del pocillo, cubriendo el área del electrodo, asegurándose de no dañar los electrodos con la punta de la pipeta.

Agregue agua a los pozos circundantes de los compartimentos, asegurando suficiente humedad, e incube PLO a 37 grados centígrados durante 1 a 2 horas. Luego, con una punta de micropipeta de plástico, aspire la mayor cantidad posible de PLO sin tocar los electrodos. A continuación, lave el pozo con 250 microlitros de agua, tres veces.

Con una punta de pipeta, retire la mayor cantidad de agua posible y deje que la superficie se seque sin la tapa. A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de laminina diluida para cubrir cada matriz de electrodos. Después de agregar agua a los compartimentos de humedad y volver a colocar la tapa, incube a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas hasta toda la noche.

El día de la siembra, después de enjuagar las neuronas motoras y los cultivos de astrocitos una vez con PBS, agregue tripsina al 0,05% e incube a 37 grados centígrados durante unos 5 minutos para levantar las células. Recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros, que contenga un inhibidor de tripsina, y lave las placas con medio o base para asegurarse de que se recolecten todas las células.

Granular las células por centrifugación y luego, con una pipeta de 1.000 microlitros, resuspender las neuronas motoras y los astrocitos con un medio de cocultivo que contiene 20 micromolares de inhibidor de ROCK para generar 1 mililitro de una suspensión unicelular. Con un hemocitómetro, cuente las neuronas motoras y los astrocitos, y mientras cuenta, tape las suspensiones celulares y colóquelas en una rejilla de espuma de poliestireno a 4 grados centígrados.

Centrifugar 1 mililitro de ambas suspensiones celulares a 300 veces g durante 5 minutos. Calcule el volumen deseado y vuelva a suspender los gránulos. Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en proporciones iguales y mezcle suavemente pipeteando dos veces para combinar completamente.

Luego, retire la laminina de cada pocillo de la placa y transfiera 10 microlitros de la suspensión celular combinada final a cada pocillo, formando una pequeña gota que cubre la matriz de electrodos. Incube las placas con una gota celular intacta a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para formar uniones iniciales en las placas.

Luego, pipetee 250 microlitros de medios de cocultivo tibios que contengan inhibidor de ROCK en la pared de cada pocillo, pipetee el mismo volumen en la pared opuesta de cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius durante 24 a 36 horas. Al día siguiente, examine las placas en busca de desechos o células muertas y, si es necesario, cambie el medio por un medio de cocultivo nuevo que contenga inhibidor de ROCK.

De lo contrario, realice intercambios de medio medio dos veces por semana utilizando un medio de cocultivo sin un inhibidor de ROCK, a partir del día 2 de cocultivo. Para realizar el registro, comience lo antes posible después del día 1 de cocultivo ajustando la temperatura a 37 grados centígrados y el dióxido de carbono al 5%. Luego, transfiera las placas a la máquina de grabación y equilibre durante al menos cinco minutos antes de grabar. Registre la actividad de referencia cada dos días o semanalmente durante 1 a 15 minutos, según el diseño experimental.