Imagen y cuantificación de agregados de proteínas en cerebros de Drosophila modificados genéticamente

Comience con cerebros de Drosophila modificados genéticamente. Estos cerebros expresan una proteína mutante marcada con fluorescencia roja en la neurona que puede extenderse a la célula glial circundante, expresando la proteína normal etiquetada con fluorescencia amarilla, causando su agregación.

Agregue una solución fijadora que preserve la integridad celular.

Retire el fijador y lave con un tampón.

Agregue un reactivo antidecoloración e incube para evitar la decoloración de las señales fluorescentes.

Transfiera los sesos a un portaobjetos y elimine el exceso de líquido.

Permita que los sesos se adhieran al portaobjetos.

Usando pequeños trozos de un cubreobjetos como espaciadores, coloque un cubreobjetos encima de ellos. Agregue reactivo antidecoloración y séllelo.

Bajo un microscopio confocal, capture imágenes utilizando diferentes longitudes de onda de excitación para fluorescencia roja y amarilla.

Utilizando un software de análisis de imágenes, cuantificar los agregados de proteínas.

La colocalización de la fluorescencia roja y amarilla indica la propagación de proteínas mutantes.

Una vez que se hayan diseccionado todos los cerebros, transfiera el tubo de recolección a un nutator a temperatura ambiente y muévalos durante unos 5 minutos. Después del período de fijación, retire la mayor parte de la solución fijadora con una pipeta P1000 y deséchela, teniendo mucho cuidado de dejar los cerebros en los tubos. Esto requiere una succión suave y una observación cuidadosa.

A continuación, agregue 1 mililitro de PBST fresco a los cerebros. Cubra el tubo y déjelo balancearse sobre el nutator durante aproximadamente un minuto para lavar el fijador restante. Luego, retire la solución y repita este breve paso de lavado.

Siga los dos lavados cortos con un lavado de 5 minutos, luego tres lavados de 20 minutos y, finalmente, un solo lavado de 1 hora. Después del último lavado, retire con cuidado la mayor parte del PBST y sumerja los cerebros en 30 microlitros de reactivo antidecoloración a base de glicerol. Luego, incube los cerebros a 4 grados centígrados en la oscuridad sin movimiento durante 1 a 24 horas.

Más tarde, extraiga los cerebros del tubo de recolección con una punta de pipeta roma y transfiéralos a un portaobjetos de microscopio. Luego, oriente suavemente los cerebros según sea necesario para obtener imágenes con fórceps. Se pueden montar varias muestras en el mismo portaobjetos en filas separadas.

A continuación, retire el exceso de reactivo antidecoloración del portaobjetos utilizando la esquina de un pañuelo de laboratorio doblado. No permita que el tejido entre en contacto con el cerebro. Luego, deje las muestras en la oscuridad durante 5 a 10 minutos para que los cerebros se adhieran al portaobjetos.

Luego, tome pequeños trozos de vidrio de cobertura rota y colóquelos alrededor del cerebro, cubriendo un área de aproximadamente 19 milímetros cuadrados. Luego, baje suavemente una cubierta de vidrio de 22 milímetros cuadrados sobre el mosaico de cerebros y vidrio para hacer un soporte de puente. A continuación, dispense lentamente un reactivo antidecoloración nuevo debajo del cubreobjetos para que llene los espacios vacíos. Haga esto con mucho cuidado para que los sesos y el vidrio permanezcan en su lugar. Luego, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Primero, simplemente aplíquelo en las esquinas. Deje que los toques de esquina se sequen de 5 a 10 minutos antes de completar el sello a lo largo de los bordes. Los cerebros deben ser fotografiados lo antes posible.

Tome imágenes de los cerebros montados utilizando un microscopio confocal equipado con un objetivo de aceite de 40x o 63x para recolectar cortes z en la región del cerebro donde se expresan los transgenes. Luego, analice los datos cuantificando los puntos en los cortes z individuales o, alternativamente, después de representar los cortes en tres dimensiones.

Para cuantificar los agregados mutantes de Huntington que están bien separados y tienen poca señal de fondo, abra la serie z confocal en el modo de visualización 3D. A continuación, utilice el Asistente de análisis para identificar manchas individuales en un canal seleccionado.

En la configuración, ajuste el umbral y los filtros para representar con precisión todos los agregados de tamaño heterogéneo como objetos individuales en la imagen. A continuación, habilite Dividir objetos en Prefiltro de procesamiento binario para separar los agregados estrechamente asociados. La información cuantitativa sobre los objetos identificados por el software se informa en Mediciones.

Después de contar los puntos, caractérelos aún más en el software de análisis de imágenes. Por ejemplo, tome medidas relevantes de los puntos o superficies para obtener información sobre el diámetro, el volumen o la intensidad de los agregados. Algunos agregados de Huntington de tipo salvaje se pueden cuantificar moviéndose manualmente a través de la pila z y contando los puntos verdes que se distinguen de la señal difusa circundante.

Tenga cuidado de evitar contar agregados individuales dos veces cuando aparecen en más de una rebanada. Otro análisis de interés es determinar la frecuencia de colocalización entre los agregados Huntington Q25-YFP y Huntington Q91-mCherry. Haga esto usando el conteo manual moviendo corte por corte a través de una pila z confocal.