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Comience con fracciones nucleares y sinápticas subcelulares recolectadas de la amígdala lateral de los cerebros de ratas condicionadas por el miedo y control.
Cada fracción subcelular contiene concentraciones variables de proteasomas 20S, el núcleo catalítico del complejo proteasoma responsable de degradar las proteínas celulares no deseadas.
Agregue un tampón de ensayo que contenga ATP y un sustrato de péptido fluorogénico a las muestras e incube.
En presencia de ATP, el proteasoma escinde el péptido fluorogénico, liberando moléculas fluorogénicas libres.
Con un lector de placas, mida la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares.
Cuantifique la fluorescencia comparándola con las concentraciones estándar conocidas de la molécula fluorogénica.
La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la actividad del proteasoma en la muestra.
El aumento de la actividad del proteasoma en la fracción nuclear de ratas condicionadas por el miedo sugiere cambios en la expresión génica relacionada con la memoria, mientras que la disminución de la actividad en la fracción sináptica indica cambios en la expresión de proteínas sinápticas necesarios para el mantenimiento de la memoria a largo plazo.
Para configurar el ensayo, precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados y manténgalo presionado durante la carrera. Establezca la Excitación en 360 nanómetros y la Emisión en 460 nanómetros. Si la placa de 96 pocillos utilizada es transparente, establezca la posición de la óptica en la parte inferior. Si se utiliza una placa oscura de 96 pocillos, establezca la posición de la óptica en Superior. Programe una ejecución cinética con un tiempo de 2 horas, escaneando cada 30 minutos.
Reconstituya el tampón de ensayo 20s 10x provisto en el kit con 13,5 mililitros de agua ultrapura. Agregue 14 microlitros de ATP 100 milimolares al tampón ahora 1x. Esto mejora significativamente la actividad del proteasoma en las muestras y mejora la fiabilidad del ensayo. Reconstituir el estándar AMC provisto en el kit con 100 microlitros de DMSO. Realice pasos utilizando el estándar AMC en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el estándar es sensible a la luz.
Cree una curva estándar de AMC a partir de una serie de concentraciones de AMC altas a bajas. Esta curva se utilizará para la calibración del lector de placas y el análisis de la actividad del proteasoma en las muestras homogeneizadas. Reconstituir el sustrato de proteasoma suministrado en el kit con 65 microlitros de DMSO. Realice también este paso en la oscuridad o en condiciones de poca luz, ya que el sustrato es sensible a la luz.
A continuación, cree una dilución de 1 a 20 del sustrato del proteasoma en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, utilizando un tampón de ensayo de 20 S. Agregue una cantidad normalizada de las muestras deseadas a una placa de 96 pocillos. Ejecute cada muestra por duplicado. La cantidad de muestra necesaria varía según la preparación del tejido. Generalmente, de 10 a 20 microgramos es suficiente para cualquier fracción subcelular.
Lleve el volumen del pocillo de muestra a 80 microlitros con agua ultrapura. La cantidad añadida depende del volumen de muestra añadida. En dos pozos separados, agregue 80 microlitros de agua solo. Estos serán los espacios en blanco del ensayo. Agregue 10 microlitros de tampón de ensayo 20 S a cada pocillo, incluidos los espacios en blanco del ensayo. Utilice un repetidor o una pipeta automatizada para garantizar un volumen de ensayo constante en todos los pocillos.
Apague las luces o entre en una habitación oscura. Agregue los 100 microlitros de estándares AMC diluidos a un nuevo pozo, usando un solo pocillo para cada estándar. En la oscuridad, use un repetidor o una pipeta automatizada para agregar 10 microlitros de sustrato de proteasoma diluido a los pocillos que contienen muestras y ensayos en blanco, pero no el estándar AMC. Coloque la placa en el lector de placas e inicie la ejecución cinética.
