Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar varios enfoques virológicos y bioquímicos para diseccionar el papel de una vía de señalización del huésped en la replicación lítica de un virus modelo de herpes. Aquí, como ejemplo, examinamos el papel de la proteína de señalización antiviral mitocondrial Mavs durante la infección por el virus del herpes gamma HV 68. Los ratones de tipo salvaje y los ratones knockout Mavs son los primeros en examinar el papel de los Mavs durante la infección aguda y los ratones knockout de Mavs tras una infección viral aguda.

Se recoge el pulmón del ratón y se determinan las cargas virales mediante un ensayo de placa en el que las muestras se diluyen y se colocan en placas. En las monocapas se cuenta el número de placas. El aumento de las cargas virales en los ratones knockout sugiere que el gen de interés desempeña un papel antiviral.

Por el contrario, la reducción de las cargas virales en ratones knockout indica que el gen es necesario para la infección viral para validar estos hallazgos. La cinética de crecimiento viral de múltiples pasos in vitro se examina en fibroblastos embrionarios de ratón, tipo salvaje y mavs. Los fibroblastos embrionarios de ratón knockout se infectan con gamma HV 68 y se incuban varias veces. A continuación, se recogen las células y se realizan ensayos de placa para comparar la cinética de crecimiento de varios pasos entre las células de tipo salvaje y las células con deficiencia de MAVS.

Para validar aún más estos hallazgos, las células embrionarias de fibroblastos embrionarios de ratón knockout de tipo salvaje y mavs están infectadas con gamma HV 68. A continuación, el ADN y el ARN se extraen por separado de las células infectadas y las transcripciones genómicas virales se analizan mediante PCR en tiempo real. La primera vez que tuvimos la idea de este protocolo fue cuando estudiamos el papel de una vía de inmunidad del huésped durante una infección por virus.

Este protocolo puede aplicarse potencialmente para investigar las reglas de las vías de señalización del huésped durante la infección por otros patógenos. Comience este procedimiento permitiendo que los ratones de seis a ocho semanas de edad se aclimaten durante un período de cuatro días después del envío. El siguiente experimento se llevará a cabo en una instalación de riesgo biológico.

En preparación, póngase el equipo de protección personal que incluye una bata de laboratorio, guantes, una mascarilla y botines trabajando en un gabinete de bioseguridad. Nivel dos. Prepare la suspensión viral con 40 a 10.000 PFU de gamma HV 68 y 30 microlitros de PBS estéril para cada ratón que vaya a ser infectado.

Mantenga la suspensión viral en hielo después de una inyección intraperitoneal de ketamina xilacina. Asegúrese de que los ratones hayan sido sedados realizando un pellizco en los dedos de los pies. Luego, con una pipeta, administre 30 microlitros de la suspensión viral gota a gota en la fosa nasal izquierda o derecha.

Coloque al ratón de lado durante cinco a 10 minutos para facilitar la entrega del virus a los pulmones por las vías respiratorias. A continuación, vuelva a colocar a los ratones en su jaula y vigílelos hasta que se hayan recuperado por completo de la sedación. A continuación, se recoge tejido pulmonar de los ratones inyectados para preparar un lisado celular para evaluar el título viral varios días después de la infección.

Coloque los pulmones extraídos de ratones sacrificados en tubos estériles de 1,5 mililitros con tapón de rosca que contengan 500 microlitros de perlas de sílice de circonio de 1,0 milímetro en hielo. Si no es así, proceda al siguiente paso el mismo día. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados.

De lo contrario, agregue un mililitro de DMEM sin suero frío. Coloque el tubo en un batidor de cuentas y presione inicio para homogeneizar los pulmones durante 30 segundos. Para evitar el sobrecalentamiento de la muestra, lo que puede inactivar el virus.

Enfríe el tubo en hielo durante al menos un minuto después de 30 segundos de homogeneización. A continuación, repita este proceso. A continuación, centrifugar el tejido homogeneizado a 16.000 RCF a cuatro grados centígrados durante un minuto.

Después del giro, los restos celulares estarán en el fondo del tubo y los lípidos estarán en la superficie. Tome inmediatamente el snat como se muestra aquí para realizar un ensayo de placa utilizando una monocapa NIH three T three o BHK 21. A continuación, se realiza un ensayo de placa Para determinar el título viral presente en la muestra, se comienza el ensayo de placa realizando una dilución en serie del sobrenadante viral.

Primero, usando una pipeta multicanal, agregue 270 microlitros de medio a una placa de 96 pocillos. Deje la primera fila en blanco. A continuación, añada 200 microlitros de sobrenadante a la primera fila de la placa de 96 pocillos, cada muestra por triplicado.

A continuación, transfiera 30 microlitros de la muestra de la primera fila a la siguiente y mezcle. Luego transfiera 30 microlitros de la mezcla a la siguiente fila y mezcle. Repita este paso varias veces para hacer diluciones en serie diez veces.

A continuación, agregue el sobrenadante viral diluido sobre la monocapa celular. En una placa de 24 pocillos. Coloque la placa en una incubadora y agite la placa cada 30 minutos durante una incubación de dos horas después de la incubación para eliminar los restos celulares, aspire el sobrenadante de la placa.

A continuación, lave las células una vez con medio fresco. Después del lavado, agregue medio que contenga metilcelulosa a las células. Incuba las células durante cuatro a seis días.

Después de cuatro a seis días han pasado. Use un microscopio para leer el número de placa de cada muestra. Registre el número de placas para cada dilución.

A continuación, calcule la media y la desviación estándar. Los pocillos que contienen demasiadas o muy pocas placas no se pueden utilizar para calcular con precisión el título. Por lo tanto, para cada muestra, use una dilución en la que haya de siete a 70 placas.

Esta muestra diluida 1000 veces tiene un promedio de 23 placas por pocillo. Para calcular el título viral en la solución sin diluir, multiplique el factor de dilución por el número de placas por el número de microlitros en un mililitro. Luego divida eso por el volumen de sobrenadante diluido agregado por pocillo.

Entonces, en este ejemplo, 1000 por 23 placas por 1000 microlitros por mililitro dividido por 100 microlitros es igual a 2,3 por 10 a la quinta unidad de formación por mililitro. A continuación, se utiliza una solución madre viral con un título conocido para determinar la cinética de crecimiento de gamma HV 68 en fibroblastos embrionarios de ratón Los ORM comienzan dividiendo los mitos de tipo salvaje y los deficientes en un gen huésped en una placa de 24 pocillos a 10.000 células por pocillo. Al día siguiente, reemplace el medio en cada pozo con 0.5 mililitros de una suspensión gamma HV 68 de bajo MOI.

Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y deje que la incubación continúe durante dos horas durante toda la incubación. Agite la placa cada 30 minutos después de la incubación. Utilice una pipeta para eliminar la suspensión viral y añada 0,5 mililitros de DM EM completo y fresco que contenga un 8% de suero bovino fetal a las células infectadas por el virus.

Vuelva a colocar las células en la incubadora varios días después de la infección. Coseche las células del extremo medio pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiéralos a tubos de centrífuga estériles de 1,5 mililitros, congele inmediatamente los tubos a menos 80 grados Celsius para liberar gamma HV 68 de los Mets.

Realice tres ciclos de congelación y descongelación. Descongele las células colocándolas a 37 grados centígrados. Luego haga vórtice y vuelva a colocarlos en el congelador a menos 80 grados centígrados.

Determine el título viral mediante un ensayo de placa utilizando una monocapa NIH three, T, three o BHK 21, como se mostró anteriormente, para examinar si la replicación del ADN o el ARN se ve afectada por una deficiencia en los genes del huésped o en los genes virales. Comience con MES infectado varios días después de la infección, deseche el sobrenadante, enjuague las células con PBS frío y células de hielo de tripsina. A continuación, granule las células por centrificación a 1000 RCF a temperatura ambiente durante un minuto después del centrifugado, deseche el sobrenadante y almacene las células a menos 80 grados centígrados.

Extraiga el ADN y el ARN totales, que son de origen huésped y viral. A continuación, centrifuga las columnas de centrifugación. Realice PCR en tiempo real utilizando ADN total y cebadores específicos para transcripciones líticas virales.

Determinar la cantidad relativa del genoma intracelular gamma HV 68 en referencia a un gen de mantenimiento del huésped como la beta actina. Prepare CDNA con ARN total y cebador DT de oligonucleótidos. Realice PCR en tiempo real utilizando CD NA y cebadores como se indicó anteriormente para determinar la cantidad relativa de transcripciones virales.

En referencia a la del gen de mantenimiento del huésped, Mavs es la abreviatura de señalización antiviral mitocondrial, como se muestra aquí. La molécula adaptadora Mavs transmite la señalización de los receptores citosólicos similares a los ojos de la plataforma para activar NF kappa B y los factores reguladores del interferón IRF que, a su vez, regulan al alza la expresión génica de citocinas e interferones proinflamatorios. Aquí se muestran las cargas virales en el pulmón de ratones de tipo salvaje infectados con gamma HV y los ratones compañeros de camada deficientes en Mavs.

La deficiencia en Mavs redujo significativamente las cargas virales en el pulmón a los 10 días después de la infección, lo que indica que Mavs es necesario para una infección viral eficiente in vivo. Esta figura muestra una curva de crecimiento viral de varios pasos en fibroblastos embrionarios de ratón de tipo salvaje, y aquellos deficientes en Mavs. Los niveles de ARNm de los genes líticos virales en gamma HV 68 infectados con fibroblastos embrionarios de ratón se analizaron mediante la deficiencia de la deficiencia de PCR en Mavs, redujeron significativamente los niveles de ARNm de tres genes líticos esenciales.

Todos estos resultados apoyan colectivamente la conclusión de que Mavs es necesario para la transcripción de gamma HV 68, la activación y la replicación lítica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo interrogar la interacción huésped-patógeno en múltiples niveles, tanto en VO como en Vevo. No olvide que trabajar con patógenos puede ser extremadamente vacilante.

Se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, durante las actuaciones.