Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

El objetivo general de este procedimiento es detectar el genoma del virus del herpes simple, tipo uno, en secciones de ganglios trigéminos de ratones laténtemente infectados mediante hibridación fluorescente in situ. Esto se logra primero inoculando el virus en el labio del animal, seguido de un período de incubación de 28 días durante el cual el virus se establece en los ganglios trigéminos. A continuación, se extraen los ganglios trigéminos, se incluyen y se seccionan por criomicrotomía.

Las secciones se someten a varios tratamientos preparatorios, incluyendo el paso clave de calentarlas en un tampón de citrato sódico. Finalmente, se realiza la hibridación fluorescente in situ utilizando sondas fluorescentes específicas para el herpes. En última instancia, los resultados pueden mostrar la ubicación del genoma viral dentro del núcleo de neuronas individualmente infectadas mediante el uso de microscopía confocal.

En muchos casos, el estudio de un ciclo vital variado requiere el uso de modelos animales. La principal ventaja de la técnica aquí presentada es que proporciona datos a nivel de célula individual mediante un enfoque de flujo institucionalizado. El modelo de ratón asesino real de infecciones por HS reproduce la mayoría de los aspectos de la historia natural de la infección por HSV uno en humanos.

Ese es el huésped natural del virus. La infección primaria ocurre en los tejidos orales, y luego el virus progresa desde los labios hasta el ganglio trigeminal. Ese es el sitio principal de latencia del VHS en humanos. Combinación de inmunomarcación y tinción.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la latencia del virus del herpes, como la forma en que el virus interactúa con los componentes nucleares y cómo estas interacciones influirían en el mantenimiento de la latencia y, eventualmente, en la reactivación del virus. Para comenzar, tenga un ratón anestesiado y una solución stock del virus HSV-1, resuspendido en medio sin rojo de fenol.

Utilizando un estereoscopio binocular, inserte la aguja en la capa subepitelial del labio superior izquierdo en el borde mucocutáneo. Inyecte 0,5 microlitros de solución vírica durante cinco segundos, y luego realice una segunda inyección de virus en el mismo sitio. Transfiera el ratón a una incubadora o almohadilla térmica a 37 grados Celsius hasta que despierte.

Luego, colóquelo en su jaula de alojamiento durante el tiempo de recuperación requerido antes de perfundirlo y fijarlo según el protocolo descrito en el texto. Corte a cada lado de la mandíbula inferior. A continuación, corte la punta de la nariz justo detrás de los incisivos para exponer la cavidad nasal.

Corte el paladar por la mitad con tijeras y luego colóquelo a un lado. Los ganglios trigeminales se encuentran debajo del paladar. Son masas blancas de forma oblonga, de dos a tres milímetros de longitud, y están conectadas al nervio trigeminal.

Corte las ramas del nervio trigémino en cada lado de los ganglios para liberarlos del bulbo raquídeo. Utilizando pinzas quirúrgicas, retire los ganglios y transfiéralos a una solución de sacarosa al 20% en PBS y déjelos incubar durante 24 horas. Al día siguiente, a temperatura ambiente, incluya ambos ganglios trigéminos en un solo bloque para corte en criostato.

Medio de inclusión, congele el bloque a menos 80 grados Celsius hasta que se corte en un criostato. Corte los ganglios trigéminos longitudinalmente en secciones de 10 micrones y recójalas en portaobjetos Super Frost calentados a 30 grados Celsius. Cuatro o cinco secciones pueden caber en un solo portaobjetos.

Asignar varias etiquetas de series a la laminilla puede ser útil. Si se planean varias aplicaciones posteriores, deje secar los cortes durante cinco a diez minutos antes de almacenarlos a menos 80 grados Celsius. Para este protocolo, la sonda se prepara etiquetando cósidos que contienen porciones de 30 kilobases del genoma del HSV uno con SI 3D CTP mediante traducción NIC.

Se precipita y se suspende en forma desionizada de amida y debe presentar un color rosa debido a la incorporación de S SI tres el primer día. Coloque los portaobjetos en un portaportaobjetos a temperatura ambiente y deje secar los cortes durante 10 minutos. Luego, rehidrate los cortes en un XPBS durante 10 minutos.

A continuación, permeabilice el tejido en Triton X-100 al 0,5 % en PBS 1X durante 20 minutos. Luego lave las laminillas tres veces durante 10 minutos cada lavado con SSC 2X y déjelas en SSC 2X hasta que el tampón desenmascarante se caliente. Para la exposición de antígenos, caliente previamente el tampón citrato en un microondas hasta que hierva el tampón.

Esto se realiza llenando una bandeja para portaobjetos de vidrio con 200 mililitros del tampón. Coloque la bandeja en un recipiente más grande lleno con 500 mililitros de agua destilada y precaliente el tampón hasta que hierva. Luego transfiera los portaobjetos a la bandeja.

Verifique que estén completamente cubiertos con tampón en el microondas. Caliente los portaobjetos en el tampón durante aproximadamente 20 segundos hasta que el tampón alcance el punto de ebullición. No permita que el tampón hierva en exceso.

Luego enfríe las laminillas a temperatura ambiente durante dos minutos y repita el ciclo de calentamiento otras seis veces. Es fundamental determinar empíricamente el número y la duración de los ciclos de calentamiento para garantizar la reproducibilidad del paso de desenmascaramiento. El horno de microondas, la bandeja, el recipiente y el volumen de tampón en la bandeja.

El volumen de agua en el recipiente debe mantenerse idéntico cuando finalice el calentamiento. Transfiera los portaobjetos a dos XSSC durante cinco minutos bajo una campana extractora, incube los portaobjetos en una solución de tres a uno a cuatro de metanol, ácido acético y PBS durante 15 minutos. A continuación, incube los portaobjetos en una mezcla recién preparada de metanol a ácido acético en proporción tres a uno durante 15 minutos.

Ahora deshidrate los cortes mediante incubaciones sucesivas de 10 minutos en etanol al 70%, seguidas de dos incubaciones de 10 minutos en etanol puro. Deje secar las laminillas a temperatura ambiente durante 10 minutos para prepararlas para la sonda. Aplique 80 microlitros de solución de sonda sobre los cortes secos gota a gota y cúbralo con un cubreobjetos.

Verifique que la solución de sonda se extienda sobre toda la superficie del cubreobjetos y que no haya burbujas. Luego, selle el cubreobjetos con cemento de goma y deje secar. Proceda con la desnaturalización incubando los portaobjetos a 80 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego, transfiera rápidamente los portaobjetos a una bandeja metálica sobre hielo durante cinco minutos. A continuación, realice una hibridación nocturna a 37 grados Celsius al día siguiente. Retire el cemento de goma con pinzas mientras los portaobjetos están en un bloque calefactor a 37 grados Celsius.

Retire suavemente la cubierta con la punta de una hoja de bisturí. A continuación, lave repetidamente las secciones con SSC. Ahora, tiña las muestras durante 10 minutos con el colorante adecuado, como DAPI o hooks 3 3 3 4 2 a 0,5 microgramos por mililitro en un XPBS.

Luego, lave las laminillas tres veces con 1 XPBS durante 10 minutos por lavado. Después del tercer lavado, elimine la mayor cantidad posible de líquido de la laminilla. A continuación, al final de cada laminilla, aplique 80 microlitros de medio de montaje con un agente antidesvanecimiento.

Cubra lentamente el medio con una laminilla de alta calidad óptica, evitando la formación de burbujas. Luego selle el portaobjetos con esmalte de uñas y almacénelo en la oscuridad a cuatro grados Celsius. Al desarrollar este protocolo, se probaron varios tampones salinos para la exposición de epítopos.

Aunque los tampones con EDTA tienden a dañar el tejido, el citrato sódico, el tris, el HCL y el agua destilada resultaron adecuados para la detección del virus HSV tipo uno, a fin de verificar que el protocolo funcionara con sondas comerciales. La detección del genoma latente de HSV tipo uno se realizó utilizando una sonda biotinilada PAN HSV tipo uno obtenida de Enzo Biochem, detectándose tanto patrones de manchas individuales como múltiples para el genoma de HSV tipo uno.

Además, el protocolo de FISH de ADN se probó en ratones y conejos infectados con tres cepas comúnmente utilizadas del virus del herpes simple tipo 1. En todos los casos, los genomas del virus del herpes simple tipo 1 mostraron una señal puntual con brillo e intensidad variables. Asimismo, se evaluó la aplicabilidad del protocolo en el ciclo replicativo del virus del herpes simple tipo 1 mediante la realización de FISH de ADN en tejidos de ratones que presentaban una infección herpética generalizada.

En estos animales, se detectaron agregados grandes y brillantes de genomas de HSV tipo uno en diversos tejidos, incluidos los ganglios de la raíz dorsal, los ojos y el cerebro. El protocolo de hibridación in situ con ADN es muy versátil. Permite la detección simultánea del genoma de HSV tipo uno y de ARN o proteínas virales o celulares.

Por ejemplo, la detección simultánea del genoma de HSV 1 junto con el ARN latente de HSV 1 es factible; la detección simultánea del genoma de HSV 1 con proteínas celulares, como la proteína centromérica CENP-A, fue utilizada; la detección simultánea de HSV 1 con la cromatina y los cuerpos nucleares PML. La proteína asociada A TRX se visualizó mediante una tinción triple que mostraba el ADN de HSV 1 en rojo, su producto de ARN lat en azul y la TRX en verde.

Una vez configurado el desenmascaramiento, el procedimiento de hibridación in situ con ADN es muy robusto. Puede realizarse en menos de 24 horas en lotes de 20 portaobjetos o más. El desarrollo de esta técnica permitirá a los investigadores que estudian los virus del herpes y otros virus persistentes explorar, a nivel de célula individual, cómo los componentes celulares y la arquitectura nuclear podrían influir en la biología de estos virus.