Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

El objetivo general de este procedimiento es detectar el genoma del virus del herpes simple, tipo uno, en secciones de los ganglios del trigémino de ratones infectados latentemente mediante hibridación fluorescente in situ. Esto se logra inoculando primero el virus en el labio del animal, seguido de un período de incubación de 28 días durante el cual el virus se establece en los ganglios del trigémino. A continuación, se cosechan los ganglios del trigémino, se incrustan y se crioseccionan.

Las secciones se someten a varios tratamientos preparatorios, incluido el paso clave de calentarlas en un tampón de citrato de sodio. Por último, la hibridación fluorescente in situ se realiza utilizando batas fluorescentes específicas para herpes. En última instancia, los resultados pueden mostrar el posicionamiento del genoma viral dentro del núcleo de neuronas infectadas individualmente mediante el uso de microscopía confocal.

En muchos casos, el estudio de un ciclo de vida diverso requiere el uso de modelos animales. El principal beneficio de la técnica que se representa aquí es que proporciona datos a nivel de una sola célula utilizando un enfoque de fluidez de instituto. El modelo asesino real de las infecciones por HS reproduce la mayoría de los aspectos de la historia natural de la infección por VHS en humanos.

Ese es el huésped natural del virus. La infección primaria se produce en los tejidos orales y luego el virus progresa desde los labios hasta los dos ganglios al. Ese es el lado principal de la latencia de HS V en humanos combinados dos inmuno y tinción.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la latencia del virus del herpes, como la forma en que el virus interactúa con los componentes nucleares y cómo estas interacciones influirían en el mantenimiento de la latencia y, finalmente, en la reactivación del virus. Para empezar, tenga un ratón anestesiado y una solución madre para un virus HSV. Resuspendido en medio libre de rojo fenol.

Con un estereoscopio binocular, inserte la aguja en la capa subepitelial del labio superior izquierdo en el borde mucocutáneo. Inyecte 0,5 microlitros de solución viral durante cinco segundos y luego haga una segunda inyección de virus en el mismo sitio. Transfiera el mouse a una incubadora o almohadilla térmica a 37 grados centígrados hasta que se despierte.

Luego colóquelo en su jaula de origen durante el tiempo de recuperación requerido antes de perfu fijándolo de acuerdo con el protocolo de texto. Corta a cada lado de la mandíbula inferior. A continuación, corta la punta de la nariz justo detrás de los incisivos para revelar la cavidad nasal.

Corta el paladar por la mitad con unas tijeras y luego colócalo a un lado. Los ganglios del trigémino se encuentran debajo del paladar. Son masas oblongas blancas, de dos a tres milímetros de largo y están conectadas al nervio trigémino.

Corta las ramas del nervio trigémino a cada lado de los ganglios para liberarlas del tronco encefálico. Con unos alicates quirúrgicos, retire los ganglios y transfiéralos al 20%Sacarosa en PBS para que se incuben durante 24 horas. A temperatura ambiente al día siguiente, incruste ambos ganglios del trigémino en un solo bloque de criosección.

Medio de inclusión, congele el bloque a menos 80 grados centígrados hasta que se seccione en un criostato. Corte los ganglios del trigémino a lo largo en secciones de 10 micras y recójalas en portaobjetos súper helados calentados a 30 grados centígrados. De cuatro a cinco secciones pueden caber en una sola guía.

Dar a la diapositiva varias etiquetas de serie puede ser útil. Si se planean varias aplicaciones posteriores, deje que las rodajas se sequen durante cinco a 10 minutos antes de almacenarlas a menos 80 grados centígrados. Para este protocolo, la sonda se prepara marcando cosms que contienen porciones de 30 kilobases del genoma de un VHS con CTP SI 3D por traducción de NIC.

Está precipitado y suspendido en forma de amida desionizada y debe aparecer rosado debido a la incorporación de S SI tres el primer día. Coloque los portaobjetos en un portaobjetos a temperatura ambiente y deje que las secciones se sequen durante 10 minutos. A continuación, rehidrata las secciones en un XPBS durante 10 minutos.

A continuación, perme el tejido en 0.5%Triton X 100 en un XPBS durante 20 minutos. A continuación, lave los portaobjetos tres veces durante 10 minutos por lavado con dos XSS y manténgalos en dos XSSC hasta que se caliente el tampón de desenmascaramiento. Para desenmascarar, precaliente el tampón de citrato en un microondas hasta que el tampón hierva.

Esto se hace llenando una bandeja portaobjetos de vidrio con 200 mililitros del tampón. Coloque la bandeja en un recipiente más grande lleno de 500 mililitros de agua destilada y precaliente el tampón hasta que hierva. A continuación, transfiera los portaobjetos a la bandeja.

Verifica que estén completamente cubiertos con tampón en el microondas. Caliente los portaobjetos en el tampón durante unos 20 segundos hasta que el tampón hierva. No deje que el tampón se desborde.

A continuación, enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente durante dos minutos y repita el ciclo de calentamiento seis veces más. Es fundamental determinar empíricamente el número y la duración de los ciclos de alimentación para la reproducibilidad de la etapa de desenmascaramiento. El horno microondas, la bandeja, el recipiente, el volumen de tampón en la bandeja.

El volumen de agua en el recipiente debe mantenerse idéntico cuando termine el calentamiento. Transfiera los portaobjetos en dos XSSC durante cinco minutos bajo una campana extractora, incube los portaobjetos en una solución de metanol, ácido acético y PBS de tres a uno a cuatro durante 15 minutos. A continuación, incube los portaobjetos en una mezcla de metanol y ácido acético de tres a uno recién preparada durante 15 minutos.

A continuación, deshidratar las secciones mediante incubaciones sucesivas de 10 minutos en etanol al 70%, seguidas de dos incubaciones de 10 minutos en etanol puro. Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 10 minutos para prepararlos para la sonda. Aplique 80 microlitros de solución de sondeo a las secciones secas gota a gota y cúbralas con un cubreobjetos.

Compruebe que la solución de sondeo se extienda por toda la superficie del cubreobjetos y que no haya burbujas. A continuación, selle el cubreobjetos con cemento de goma y déjelo secar. Proceda con la desnaturalización incubando los portaobjetos a 80 grados centígrados durante cinco minutos.

Luego, transfiera rápidamente los portaobjetos a una bandeja metálica con hielo durante cinco minutos. Siga esto con una hibridación durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Retire el cemento de goma con pinzas con los portaobjetos en un bloque de calor a 37 grados centígrados.

Retire el cubreobjetos suavemente con la punta de una hoja de bisturí. A continuación, lave las secciones repetidamente con SSC. Ahora, tiñe las muestras durante 10 minutos con el colorante adecuado como DAPI o ganchos 3 3 3 4 2 a 0,5 microgramos por mililitro en un XPBS.

A continuación, lave los portaobjetos tres veces con un XPBS durante 10 minutos por lavado. Después del tercer lavado, drene la mayor cantidad de líquido posible del portaobjetos. Luego, al final de cada portaobjetos, aplique 80 microlitros de medio de montaje con un agente antidecoloración.

Cubra lentamente el medio con un cubreobjetos de alta calidad óptica, evitando la formación de burbujas. A continuación, sella el portaobjetos con esmalte de uñas y guárdalo en la oscuridad a cuatro grados centígrados. En el desarrollo de este protocolo, se probaron varios tampones de sal para el desenmascaramiento.

Mientras que los tampones de EDTA tendían a dañar el tejido. El citrato de sodio tris, HCL y agua destilada fueron adecuados para la detección de HSV uno para verificar que el protocolo funcionaría con sondas comerciales. La detección del genoma latente del VHS uno se realizó utilizando una sonda biotinilada PAN HSV una obtenida de Enzo Biochem, se pudieron detectar patrones de punto único y múltiple para el genoma de un genoma del VHS.

Además, el protocolo de ADN de peces se probó en ratones y conejos infectados con tres cepas de VHS uno de uso común. En todos los casos, los genomas del VHS uno mostraron una señal irregular con brillo e intensidad variables. Además, se probó la aplicabilidad del protocolo en el ciclo replicativo del VHS uno mediante la realización de peces de ADN en tejidos de ratones sometidos a una infección general por herpes.

En estos animales, se detectaron agregados grandes y brillantes de genomas de HSV one en varios tejidos, incluidos los ojos y el cerebro de DRG. El protocolo de ADN de peces es muy versátil. Permite la detección conjunta del VHS, un genoma y ARN y proteínas virales o celulares.

Por ejemplo, la detección conjunta de un genoma del VHS junto con el ARN latita del VHS es factible, la detección conjunta del genoma del VHS con proteínas celulares como la proteína CE NPA A del Centro MERIC se utilizó la detección conjunta del VHS uno con los cuerpos nucleares de la cromatina y PML. La proteína A TRX asociada se visualizó con una tinción triple que mostraba HSV 1D NA en rojo. Su producto de ARN lat en azul y un TRX en verde.

Una vez que se establece el desenmascaramiento, el procedimiento de peces de ADN es muy sólido. Se puede hacer en menos de 24 horas en lotes de 20 portaobjetos o más. El desarrollo de esta técnica permitirá a los investigadores que investigan los virus del herpes y otros virus persistentes explorar, a nivel de una sola célula, cómo los componentes celulares y la arquitectura nuclear podrían influir en la biología de estos virus.