Microscopía de dos fotones para estudiar la atracción del proceso microglial hacia un compuesto en un corte de cerebro de ratón

Coloque un corte de cerebro de ratón en una cámara de perfusión que contenga aCSF bajo un microscopio de dos fotones.

El ratón está diseñado genéticamente para expresar GFP en la microglía, lo que permite el seguimiento del movimiento microglial.

Asegure la rebanada con un soporte.

Usando iluminación de campo claro, ubique la región de interés.

Cambie a iluminación de fluorescencia para visualizar la microglía.

Llene una micropipeta con el compuesto de prueba, móntela en un soporte de jeringa y bájela para tocar la rebanada.

Active el modo de imágenes de dos fotones, enfocando la luz infrarroja cercana de baja energía en el tejido.

En el punto focal del láser, dos fotones combinan su energía para excitar GFP, emitiendo fluorescencia.

Capture imágenes en múltiples planos Z para centrarse en los procesos microgliales.

Registre la actividad de referencia, luego inyecte el compuesto y continúe registrando.

El compuesto se une a los receptores microgliales, desencadenando vías de señalización que impulsan la extensión del proceso microglial hacia la fuente del compuesto.

Monitoree el aumento de fluorescencia cerca del lugar de la inyección a lo largo del tiempo para rastrear el movimiento.

30 minutos antes de iniciar la grabación, conecte la bomba peristáltica a una cámara de grabación personalizada con perfusión superior e inferior para optimizar la oxigenación y viabilidad de los cortes de tejido y limpie todo el sistema de perfusión con 50 mililitros de agua ultrapura. Al final del ciclo de limpieza, inicie la perfusión de la cámara de registro con 50 mililitros de aCSF en un vaso de precipitados de vidrio bajo carbogenación constante y use una pipeta de transferencia desechable de boca ancha para transferir la primera rebanada a fotografiar al vaso de precipitados para quitar el papel de la lente.

Cuando la sección se haya hundido hasta el fondo del vaso de precipitados, transfiera la sección a la cámara de registro y coloque el soporte de la rebanada en la rebanada para minimizar el movimiento inducido por el flujo de perfusión. Utilice la iluminación de campo claro para apuntar a la región cerebral de interés con un aumento de 5 a 10 veces. A continuación, utilice un objetivo de 25 veces con una lente de inmersión en agua de 0,35 veces para ajustar la posición del campo de visión.

Utilice la iluminación de fluorescencia para localizar las células microgliales fluorescentes y rellene la pipeta con 10 microlitros de aCSF que contiene el compuesto de interés en su concentración final. Apunte la punta hacia abajo agitando suavemente para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la punta y monte la pipeta llena en un soporte de pipeta conectado a una jeringa de 5 mililitros, con un émbolo colocado en la posición de 5 mililitros y montado en un micromanipulador de tres ejes.

Baje la pipeta suavemente hacia el corte, controlando y ajustando el objetivo al mismo tiempo, hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la superficie del corte. Ahora ajuste el láser y cambie el microscopio al modo multifotón. Asegúrese de que la cámara esté protegida de cualquier fuente de luz y encienda los detectores no escaneados. Establezca la ganancia y use una tabla de búsqueda con un límite superior codificado por colores para evitar saturar los píxeles de la imagen.

Luego comience a grabar durante un total de al menos 30 minutos, presionando lentamente el émbolo de la jeringa de la posición de 5 a 1 mililitro después de cinco minutos durante un período de 5 segundos para aplicar el compuesto a la sección. Para el análisis de imágenes, primero realice la proyección Z y la corrección de deriva con ImageJ en el archivo de interés. Luego abra el archivo modificado en Icy y dibuje una región circular de interés de 35 micrómetros de diámetro centrada sobre el sitio de inyección.

Vuelva a ejecutar la película con el ROI para asegurarse de que está bien posicionada. Luego, use el complemento Evolución de intensidad de la región de interés para medir la intensidad media a lo largo del tiempo en la región de interés y guarde los resultados como un archivo .xls.