Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Coloque un tejido retiniano aislado de un ratón transgénico con células ganglionares de la retina marcadas con fluorescencia, o RGC, en una cámara de registro.

La información visual se transmite a las RGC, cuyos axones la transmiten al cerebro a través del nervio óptico.

Los subtipos de RGC se distinguen por los patrones de ramificación de sus dendritas, que se estratifican en subcapas dentro de la capa interna de la retina.

Aplanar el tejido de la retina y asegurarlo con un anclaje de tejido.

Transferir la cámara a una platina de microscopio y perfundir una solución oxigenada para mantener la viabilidad de la RGC.

Usando iluminación infrarroja, identifique los RGC fluorescentes.

Coloque una pipeta que contenga un trazador fluorescente en un RGC.

Aplique presión positiva para evitar obstrucciones.

Cambie a presión negativa, introduciendo la membrana en la pipeta para formar un sello.

Aplique succión para romper la membrana, estableciendo una configuración de toda la célula que facilite la difusión del trazador en las dendritas.

Observe la morfología dendrítica y la estratificación para identificar los subtipos de RGC.

Lave la retina en la solución extracelular oxigenada y transfiérala a una cámara de registro con fondo de vidrio con una pipeta de transferencia de plástico. Después de eso, use fórceps para aplanar cuidadosamente el tejido con la capa de fotorreceptores hacia abajo. Elimine el exceso de líquido con una pipeta. Y ancle el tejido con un anillo de platino con malla de nailon. Luego llene la cámara con la solución extracelular oxigenada y móntela en una platina de microscopio. Perfundir el tejido con la solución extracelular oxigenada a 2 a 4 mililitros por minuto.

Para prepararse para este procedimiento, tire de algunas micropipetas de vidrio para registros electrofisiológicos con un extractor de micropipetas. Observe la capa de células ganglionares utilizando la óptica IR-DIC. Luego identifique las células ganglionares de GFP más usando epifluorescencia a aproximadamente 480 nanómetros. A continuación, localice la pipeta llena de solución intracelular en CID. Aplique una ligera presión positiva y ponga a cero cualquier compensación de voltaje en el amplificador.

Posteriormente, baje la micropipeta de vidrio en una celda positiva para GFP y aplique los pasos de comando de voltaje de prueba para monitorear la resistencia del sello. La presión negativa debe formar un sello de Giga ohmios entre la pipeta y la membrana celular. Después de formar un sello estable, rompa la membrana aplicando breves pulsos de presión negativa para obtener acceso a toda la celda. Espere uno o dos minutos para que las dendritas de la célula se llenen de marcador fluorescente.